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Msf/Fragment 065 04

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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 65, Zeilen: 4-7, 10-25
Quelle: Maerten 2004
Seite(n): 81, Zeilen: 24 ff.
Die Real-Time-PCR dient zur Quantifizierung von Transkripten auf cDNS-Ebene. Bei dieser PCR-Methode wird, wie auch bei der Visualisierung von DNS im Agarosegel durch Ethidiumbromid, die Fluoreszenz von DNS-bindenden Farbstoffen gemessen. Hier wird ein fluoreszierender Farbstoff (z.B. SYBR-Green™) eingesetzt, der an doppelsträngige DNS sequenzunspezifisch mit einer etwa 100mal höheren Affinität als Ethidiumbromid bindet (Morrison et al., 1998). Das Exzitationsmaximum des verwendeten Farbstoffes liegt bei 494 nm, das Emmisionsmaximum bei 520 nm.

Da die DNS während einer PCR amplifiziert wird, nimmt die Fluoreszenz, die nach jedem Zyklus bestimmt wird, in Form einer sigmoidalen Wachstumskurve zu. Durch die hier verwendete Methode konnte die Menge der Transkripte relativ, nicht absolut, bestimmt werden. Da bei dieser quantitativen Methode Pipettierfehler minimiert werden sollten, wurde folgender 10x Pre-mix pro jeweiliges Primer-Paar angesetzt. Pre-Mix für 12 Reaktionen: 125 μl SybrGreen-Lösung 10 μl 10 pmol/μL-1 Primer A 10 μl 10 pmol/μL-1 Primer B 75 μl HPLC-H2O 220 μl Gesamtvolumen Von diesem Pre-mix wurden jeweils 18 μL in die jeweilige Kavität des PCR Reaktionsgefäßes vorgelegt und anschließend 3 μL cDNS zugegeben.

4.10.5.3 Real-Time-PCR

Die Real-time-PCR dient zur Quantifizierung von Transkripten auf cDNA-Ebene. Bei dieser PCR-Methode wird, wie auch bei der Visualisierung von DNA im Agarosegel durch Ethidiumbromid, die Fluoreszenz von DNA-bindenden Farbstoffen gemessen. Da die DNA während einer PCR amplifiziert wird, nimmt die Fluoreszenz, die nach jedem Zyklus bestimmt wird, in Form einer sigmoidalen Wachstumskurve zu. Durch die hier verwendete Methode konnte die Menge der Transkripte relativ, nicht absolut, bestimmt werden.

Das Exicationsmaximum [sic] des verwendeten Farbstoffes liegt bei 497nm, das Emmisionsmaximum bei 520 nm. SyprGreenTM-Stammlösung: 100 x in DMSO SyprGreenTM-Arbeitslösung: 1 x in HPLC -H2O Ansatz für eine Reaktion: 2,0 μL 10× PCR-Puffer (mit MgCl2, [1,5 mM]) 2,0 μL SybrGreen-Arbeitslösung 0,4 μL 10 mM dNTPs 0,8 μL 10 pmol·μL-1 Primer A 0,8 μL 10 pmol·μL-1 Primer B 0,1 μL Taq-Polymerase (5 U·μL-1) 2,0 μL DNA-Matrize 13,9 μL HPLC-H2O Da bei dieser quantitativen Methode Pipettierfehler minimiert werden sollten, wurde folgender 20 x Pre-mix pro jeweiligem Primer-Paar angesetzt. Pre-mix für 20 Reaktionen: 40 μL 10× PCR-Puffer (mit MgCl2, [1,5 mM]) 40 μL SybrGreen-Arbeitslösung 8 μL 10 mM dNTPs 16 μL 10 pmol·μL-1 Primer A 16 μL 10 pmol·μL-1 Primer B 2,0 μL Hotstar-Taq-Polymerase (5 U·μL-1) 2,0 μL cDNA-Matrize 238 μL HPLC-H2O Von diesem Pre-mix wurden jeweils 18 μL in die jeweilige Kavität des PCR-Reaktionsgefäßes vorgelegt und anschließend 2 μL Probe zugegeben.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Ein Satz, der nicht der Quelle zugeordnet werden kann, ist nicht als Plagiat gewertet.

Sichter
(SleepyHollow02) Singulus

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