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Nk/Fragment 073 01

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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Bummelchen, Hindemith, Cassiopeia30, Frangge
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 73, Zeilen: 1-31
Quelle: Vahl 1995
Seite(n): 186, 187, Zeilen: 7ff
[Da derzeit kein Verfahren einer lnvivokalibrierung mit FURA beschrieben ist, besteht die Möglichkeit, dass bei der Berechnung der Absolutwerte für die intrazellulären] Calciumkonzentrationen ein beträchtlicher Irrtum auftreten könnte. Eine Akkumulation von FURA außerhalb des Zytosols, in Mitochondrien und im sarkoplasmatischen Retikulum könnte auftreten. Bei einer Verkürzung des Muskels würden damit, nicht nur nicht gleichmäßig mit FURA beladene Muskelzellen jeweils angeregt werden, sondern die FURA-Konzentration könnte auch zwischen nebeneinanderliegenden Muskelquerschnitten jeweils unterschiedlich sein. Dennoch würde eine ungleichmäßige FURA-Beladung die Messungen nicht grundsätzlich stören, da die Quotientenmethode verwendet worden ist und die Änderungen dementsprechend gleichgerichtet in Zähler und Nenner zu erwarten wären (45).

Es ist bekannt, dass die Calciumbindungskinetik von FURA innerhalb von vitalen Muskelzellen im Vergleich zu den unter dem Mikroskop betrachteten FURA-haltigen Lösungen reduziert ist (164). Ursächlich könnte das intrazelluläre Verhältnis von FURA zu anderen intrazellulären calciumbindenden Proteinen, die in der Zelle um das Calcium konkurrieren, eine Rolle spielen (12, 80, 113).

Für die Kalibrierung wurden die Werte für Rmax an dem intakten, tetanisierten Muskelpräparat am Ende des Experimentes bestimmt. Es ist grundsätzlich schwer auszuschließen, dass im Verlauf des Experimentes durch Photolyse Produkte entstehen, die ihrerseits fluoreszent sind und damit das Signal verfälschen könnten. Auch eine zunehmende Kompartimentierung von FURA in Zellorganellen kann die Kalibrierung erschweren (6, 20, 72). Demgegenüber erfolgte die Messung von Rmin erst nach vorangegangener Behandlung mit TRITON-X-100 („rapid skinning"). Bei der Bestimmung von Rmin dürften daher die Zellorganellen keine störende Rolle mehr gespielt haben können.

Es muss zusammenfassend grundsätzlich mit der Möglichkeit gerechnet werden, dass die Angaben zu den Absolutwerten für die intrazellulären Calciumkonzentrationen revidiert werden müssten, wenn die Kinetik der intrazellulären Verteilung von FURA besser bekannt bzw. ein anderes Verfahren zur Kalibrierung des Systems eingeführt ist. Es war jedoch grundsätzlich nicht das Ziel der gegenwärtigen Untersuchung, quantitative Vergleiche hinsichtlich der Absolutwerte der intrazellulären Calciumkonzentrationen durchzuführen. Die Berechnungen des intrazellulären Calciumtransienten dienten in erster Linie dem Ziel, die Größenordnung abzuschätzen, [um sicherzugehen, dass die Messungen innerhalb des Messbereiches von FURA durchgeführt wurden.]

(6) Almers W, Neher E (1985) The Ca signal frorn fura-2 loaded mast cells depends strongly on the method of dye-loading. FEBS Lett, 192: 13-18

(12) Baylor SM, Hollingworth S (1988) Fura-2 calcium transients in frog skeletal muscle fibres. J Physiol (Lond.) 405: 233-255

(20) Blatter LA, Wier WG (1990) lntracellular diffusion, binding and compartmentation of the fluorescent calcium indicators indo-1 and fura-2. Biophys J, 58: 1491-1499

(45) Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY (1985) A new generation of Calcium indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem, 260: 3440-3450

(72) Jacobs R, Lieberman M (1986) Compartmentation of fura-2 in cultures of embryonic chick heart cells (Abstract). J Physiol (Lond), 382: 10/P

(80) Klein MG, Simon BJ, Szucs G, Schneider MF (1988) Simultaneous recording of calcium transients in skeletal muscle using high and low affinity indicators. Biophys J, 53: 971-988

(113) Noble D, Powell T (1991) The slowing of Ca2+ signals by Ca2+-indicators in cardiac muscle. Proc R Soc Lond B Bio1 Sci, 246: 167-172

(164) Wier WG, Cannel MB, Berlin JR, Marban E, Lederer WJ (1987) Cellular and subcellular heterogenity of Ca2+ in Single heart cells revealed by FURA-2. Science 235:325-328

Da derzeit kein Verfahren einer in-vivo Kalibrierung mit FURA beschrieben

ist, besteht die Möglichkeit, daß bei der Berechnung der Absolutwerte für die intracellulären Calciumkonzentrationen ein beträchtlicher Irrtum auftreten könnte. Eine Akkumulation von FURA außerhalb des Cytosols in Mitochondrien und im sarkoplasmatischen Retikulum könnte auftreten. Bei einer Verkürzung des Muskels würden damit nicht gleichmäßig mit FURA beladene Muskelzellen jeweils angeregt werden, sondern die FURA-Konzentration könnte auch zwischen nebeneinanderliegenden Muskelquerschnitten jeweils unterschiedlich sein. Dennoch würde eine ungleichmäßige FURA-Beladung die Messungen nicht grundsätzlich stören, da die Quotientenmethode verwendet worden ist und die Änderungen dementsprechend gleichgerichtet in Zähler und Nenner zu erwarten wären (113).

Es ist bekannt, daß die Calcium-Bindungskinetik von FURA innerhalb von vitalen Muskelzellen im Vergleich zu den unter dem Mikroskop betrachteten FURA-haltigen Lösungen reduziert ist (243, 246). Ursächlich könnte das intracelluläre Verhältnis von FURA zu anderen intracellulären Calcium-bindenden Proteinen, die in der Zelle um das Calcium konkurrieren, eine Rolle spielen (19, 179, 225).

Für die Kalibrierung wurden die Werte für Rmax an dem intakten, tetanisierten Muskelpräparat am Ende des Experimentes bestimmt. Es ist grundsätzlich schwer auszuschließen, daß im Verlauf des Experimentes durch Photolyse Produkte entstehen, die ihrerseits fluoreszent sind und damit das Signal verfälschen. Auch eine zunehmende Kompartimentierung von FURA in Zellorganellen kann die Kalibrierung erschweren (7, 32, 158, 298). Demgegenüber erfolgte die Messung von Rmin erst nach vorangegangener Behandlung mit TRITON-X-l00 ("rapid skinning"). Bei der Bestimmung von Rmin dürften daher die Zellorganellen keine störende Rolle mehr spielen können.

Es muß zusammenfassend grundsätzlich mit der Möglichkeit gerechnet werden, daß die Angaben zu den Absolutwerten für die intrazellulären Calciumkonzentrationen revidiert werden müßten, wenn die Kinetik der intrazellulären Verteilung von FURA besser bekannt ist bzw. ein anderes Verfahren zur Kalibrierung des Systems eingeführt ist. Es war jedoch grundsätzlich nicht das Ziel der gegenwärtigen Untersuchung, quantitative Vergleiche hinsichtlich der Absolutwerte der intrazellulären Calciumkonzentrationen bei normalen Spenderherzen und Empfängerherzen mit dilatativer Cardiomyopathie durchzuführen. Die Berechnungen des intrazellulären Calciumtransienten dienten in erster Linie dem Ziel, die Größenordnung abzuschätzen, um sicherzugehen, daß die Messungen innerhalb des Meßbereiches von FURA durchgeführt wurden.

7) Almers W, Neher E (1985) The Ca signal from fura-2 loaded mast cells depends strongly on the method of dye-loading. FEBS Lett 192: 13-18

19) Baylor SM, Hollingworth S (1988) Fura-2 calcium transients in frog skeletal muscle fibres. J Physiol (London) 405: 233-255

32) Blatter LA, Wier WG (1990) Intracellular diffusion, binding and compartmentation of the fluorescent calcium indicators indo-1 and fura-2. Biophys J 58: 1491-1499

113) Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY (1985) A new generation of Calcium indicators with greatly improved fluorescence properties J Biol Chem 260: 3440-3450

158) Jacobs R, Lieberman M (1986) Compartmentation of fura-2 in cultures of embryonic chick heart cells (Abstract). J Physiol (London) 382: 107P

179) Klein MG, Simon BJ, Szucs G, Schneider MF (1988) Simultaneous recording of calcium transients in skeletal muscle using high and low affinity indicators. Biophys J 53: 971-988

225) Noble D, Powell T (1991) The slowing of Ca2+ signals by Ca2+-indicators in cardiac muscle. Proc R Soc Lond B Biol Sci 246: 167-172

243) Pieske B, Kretschmann B, Schmidt-Schweda S, Kazatomo M, Posival H, Just H, Hasenfuß G (1993) Alterations in intracellular Calcium Handling are a major cause for the inverse force frequency relationship in the failing human myocardium. Circulation 88 (4): 2004

246) Preusse CJ, Winter J, Schulte HD, Bircks W (1985) Energy demand.of cardioplegically perfused human hearts. J Cardiovasc Surg 26: 558-563

298) Sumbera J, Kruta V, Braveny P (1966) Influence of a rapid change of temperature on the mechanical response of mammalian myocardium. Arch Int Physiol Biochem 74: 627-641

Anmerkungen

Fortsetzung von S. 72. Die ganze Seite ist fast wörtlich übernommen. Die einzige wesentliche Änderung besteht darin, dass der Zusatz "bei normalen Spenderherzen und Empfängerherzen mit dilatativer Cardiomyopathie" entfernt wurde.

Sichter
Hindemith

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