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| Untersuchte Arbeit: Seite: 46, Zeilen: 1-21, 26-33 |
Quelle: Opretzka 2005 Seite(n): 67, 68, Zeilen: 67: 3-11, 18ff.; 68: 1 |
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| [FUJIMOTO konnte zeigen, dass durch die Behandlung der Platin/Kohle Replikas mit NDS fast alle zellulären Komponenten entfernt werden - ähnlich wie] mit der herkömmlichen Chlorbleiche - außer denen jedoch, die in direktem Kontakt mit dem Platin/Kohle Replika sind; dies sind die Membranbruchflächen mit den inkorporierten Membranproteinen. Die Membranproteine bleiben in den Replikas erhalten und sind für eine immunzytochemische Darstellung zugänglich.
Diese NDS-Gefrierbruch-Immunzytochemie ist allen bisherigen Methoden überlegen und zurzeit die Methode der Wahl bei der Identifizierung von Membranproteinen in situ. Im Gegensatz zur Originalmethode von FUJIMOTO (1995) benutzen wir, bevor die Zellen tiefgefroren werden, eine kurze, maximal 3 min dauernde Behandlung mit Glycerin aus folgenden Gründen:
Ein großes Problem bei der immunelektronenmikroskopischen Lokalisierung von Proteinen ist der mögliche Verlust der Antigenizität, der durch die notwendige Fixierung der Zellen oder Gewebe eintreten kann. Für die Fixierung werden Aldehyde eingesetzt, wobei Formaldehyd und Glutaraldehyd am häufigsten verwendet werden. Durch die Glutaraldehydfixierung erreicht man aufgrund der intensiven Quervernetzung zellulärer Proteine eine gute Erhaltung der Zellstruktur; allerdings geht dabei in der Regel die Antigenizität verloren. |
Fujimoto konnte zeigen, dass durch die Behandlung der Platin/Kohle Replikas mit SDS fast alle zellulären Komponenten entfernt werden – ähnlich wie mit der herkömmlichen Chlorbleiche - außer denen jedoch, die in direktem Kontakt mit dem Platin/Kohle Replika sind; dies sind die Membranbruchflächen mit den inkorporierten Proteinen. Die Membranproteine bleiben in den Replikas erhalten und sind für eine immunzytochemische Darstellung zugänglich.
Die von Fujimoto entwickelte SDS-Gefrierbruch-Immunzytochemie ist allen bisherigen Verfahren überlegen. [...] Im Gegensatz zur Originalmethode von Fujimoto (1995) benutzen wir, bevor die Zellen tiefgefroren werden, eine kurze, maximal 3 min dauernde Behandlung mit Glycerin aus folgenden Gründen: Da wir Gefrierbrüche in der uns zur Verfügung stehenden Balzers Gefrierbruchanlage nur mit Hilfe eines Messers durchführen können, entstehen große Druckkräfte auf den zu schneidenden bzw. brechenden Eisblock. Der Zusatz von Glycerin wirkt stabilisierend und verstärkt die Haftung des Eisblocks an die Unterlage, so dass er nicht so leicht weggebrochen wird. Weiterhin bewirkt die Behandlung der Proben mit Glycerin eine geringere Eiskristallbildung und damit einen besseren ultrastrukturellen Erhalt und eine detailliertere Darstellung der Organellen, insbesondere der Membranen kleiner Organellen und Vesikel. Bei der immunelektronenmikroskopischen Lokalisierung von Proteinen stellt die notwendige Fixierung der Zellen oder Gewebe ein großes Problem dar. In immunelektronenmikroskopischen Untersuchungen an Lipidtropfen und ihren zugehörigen Proteinen wurden einerseits die Aldehyde Formaldehyd und Glutaraldehyd eingesetzt (Blanchette-Mackie et al., 1995; Brasaemle et al., 2000a,b), anderseits Alkohole wie Methanol (Jiang und Serrero, 1992; Heid et al., 1998) und Azeton (Barba et al., 1997; Frolov et al., 2000; Atshaves et al., 2001). Durch die Glutaraldehydfixierung erreicht man aufgrund der intensiven Quervernetzung zellulärer Proteine eine gute Erhaltung der Zellstruktur; allerdings geht dabei in der [Seite 68] Regel die Antigenizität verloren. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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