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Quelle:Ad/Bente 2003

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Angaben zur Quelle [Bearbeiten]

Autor     Dennis Axel Bente
Titel    Evaluierung konventioneller und real-time RT-PCR-Protokolle für die spezifische Diagnose des Virus der Klassischen Schweinepest
Ort    Hannover
Jahr    2003
Anmerkung    Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
URL    http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/bented_ws03.pdf

Literaturverz.   

nein
Fußnoten    nein
Fragmente    20


Fragmente der Quelle:
[1.] Ad/Fragment 056 17 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-07 23:49:57 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 56, Zeilen: 17-29
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 16, Zeilen: 3 ff.
2.16.1 Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) ist seit ihrer Entdeckung zu einer der wichtigsten Techniken in der modernen Biomedizin geworden (MULLIS & FALOONA 1987). Immer günstigere Reagenzien und eine stetige Vereinfachung und Automatisierung einzelner Teilschritte machen die Technik auch zunehmend für Routineuntersuchungen einsetzbar. Die PCR ist eine in vitro-Technik zur gezielten Vermehrung eines spezifischen DNA-Genomfragmentes, das zwischen zwei Regionen mit bekannter Nukleotidsequenz liegt. Die PCR ermöglicht die Amplifikation sehr geringer Nukleinsäuremengen aus den unterschiedlichsten Materialien (MULLIS & FALOONA 1987). Das Prinzip der PCR lässt sich wie folgt beschreiben (Abb.2): Zunächst erfolgt die Denaturierung der doppelsträngigen DNA (dsDNA), an welche sich am 5`- und 3`-Ende des zu amplifizierenden Bereichs spezifische Oligonukleotide, die Primer, anlagern. Dieser Vorgang wird als Annealing bezeichnet. Die Oligonukleotide werden von einer DNA [abhängigen DANN Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTPs) verlängert (Elongation).]

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) ist seit ihrer Entdeckung vor 16 Jahren zu einer der wichtigsten Techniken in der modernen Biomedizin geworden (MULLIS u. FALOONA 1987). Immer günstiger werdende Reagenzien und eine stetige Vereinfachung und Automatisierung einzelner Teilschritte machen die Technik auch zunehmend für Routineuntersuchungen einsetzbar.

Die PCR ist eine in vitro Technik zur gezielten Vermehrung eines spezifischen DNA- Genomfragmentes, das zwischen zwei Regionen mit bekannter Nukleotidsequenz liegt. Die PCR ermöglicht die Vervielfältigug [sic] (Amplifikation) sehr geringer Nukleinsäuremengen aus den unterschiedlichsten Materialien (MULLIS u. FALOONA 1987). Das Prinzip der PCR lässt sich wie folgt beschreiben (Abb. 2.3): Zunächst erfolgt die Denaturierung der doppelsträngigen DNA (dsDNA), an welche sich am 5`- und 3`-Ende des zu amplifizierenden Bereichs spezifische Oligonukleotide, die Primer, anlagern. Dieser Vorgang wird als Annealing bezeichnet. Die Oligonukleotide werden von einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTPs) verlängert (Elongation).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Singulus

[2.] Ad/Fragment 057 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 09:15:21 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 57, Zeilen: 1-11, 12-15
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 16, 17, Zeilen: 16: 15 ff.; 17: 1 f.
[Die Oligonukleotide werden von einer DNA] abhängigen DANN Polymerase [sic] in Anwesenheit freier Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTPs) verlängert (Elongation). Die DNA-Polymerase verlängert den entstehenden DNA-Doppelstrang so lange, bis sie von der DNA „abfällt“ oder die Reaktion unterbrochen wird (Abb.2). Dieser Abbruch kann z.B. durch eine Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 95 °C verbunden mit einer wiederholten Denaturierung der dsDNA erfolgen. Kühlt man den Reaktionsansatz in Anwesenheit freier Oligonukleotide auf 40-60 °C herunter, so binden diese in Abhängigkeit ihres mittleren Schmelzwertes (TM-Wertes) an die komplementäre Sequenz der DNA-Matrize. Die Synthese eines weiteren Doppelstranges kann nun wiederholt werden (ERLICH 1989; MULLIS & FALOONA 1987). Die Abfolge dieser drei Reaktionsschritte wird als Zyklus bezeichnet. Diese Zyklen werden zwischen 25 bis 40-mal wiederholt (MÜLHARDT 2002).

[ABBILDUNG]

Rein theoretisch verdoppelt sich in der PCR die Anzahl an DNA-Molekülen von Zyklus zu Zyklus. Aus einem Zielmolekül würden so innerhalb von dreißig Zyklen etwa eine Milliarde und nach vierzig Zyklen sogar 1012 [sic] Moleküle. Der rein theoretische Multiplikationsfaktor wäre hier also 2. Tatsächlich liegt der durchschnittliche Multiplikationsfaktor (bezogen auf [die Gesamtreaktion) je Zyklus bei ca. 1,6 bis 1,7 (KAINZ 2000).]

Die Oligonukleotide werden von einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTPs) verlängert (Elongation). Die DNA-Polymerase verlängert den entstehenden DNA-Doppelstrang so lange, bis sie von der DNA „abfällt“ oder die Reaktion unterbrochen wird (Abb. 2.3). Dieser Abbruch kann z.B. durch eine Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 95 °C verbunden mit einer wiederholten Denaturierung der dsDNA erfolgen. Kühlt man den Reaktionsansatz in Anwesenheit freier Oligonukleotide auf 40-60 °C herunter, so binden diese in Abhängigkeit ihres mittleren Schmelzwertes (TM-Wertes) an die komplementäre Sequenz der DNA-Matrize. Die Synthese eines weiteren Doppelstranges kann nun wiederholt werden (ERLICH 1989; MULLIS und FALOONA 1987). Die Abfolge dieser drei Reaktionsschritte wird als Zyklus bezeichnet. Diese Zyklen werden zwischen 25 bis 40-mal wiederholt (MÜLHARDT 2002).

[...]

Rein theoretisch verdoppelt sich in der PCR die Anzahl an DNA-Molekülen von Zyklus zu Zyklus. Aus einem Zielmolekül würden so innerhalb von dreißig Zyklen etwa eine Milliarde und nach vierzig Zyklen sogar eine Billionen Moleküle. Der rein theoretische Multiplikationsfaktor wäre hier also 2. Tatsächlich liegt der durchschnittliche

[Seite 17]

Multiplikationsfaktor (bezogen auf die Gesamtreaktion) je Zyklus bei ca. 1,6 bis 1,7 (KAINZ 2000)..

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Die Abbildung stammt nicht aus der hier dokumentierten Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[3.] Ad/Fragment 058 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-09 11:38:42 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 58, Zeilen: 1-5, 6-15
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 16, 17, 18, Zeilen: 16: letzte Zeile, 17: 1 ff.; 18: 4 ff.
[Tatsächlich liegt der durchschnittliche Multiplikationsfaktor (bezogen auf] die Gesamtreaktion) je Zyklus bei ca. 1,6 bis 1,7 (KAINZ 2000). Dies liegt daran, dass die Vermehrungsrate am Ende der PCR geringer ist, als in der Mitte der Zyklenanzahl (Abb.3). Zu Beginn und in der Mitte der Reaktion ist der Multiplikationsfaktor 2 und die Vermehrungsrate ist exponentiell. Gegen Ende geht die Reaktion in eine lineare und schließlich in eine Plateau-Phase über (Abbildung 3; nach KAINZ 2000 modifiziert).

Ad 58a diss.png

Abbildung 3: Grafische Darstellung einer idealisierten PCR (nach KAINZ 2000 modifiziert).

[...]

Das Phänomen der Verringerung der Vermehrungsrate während einer PCR hat mehrere Ursachen. So wird zum einen die Aktivität der Polymerase durch die Bindung an neu synthetisierte Produkte (ab einer Konzentration von ca. 0,3-1 pmol; (MÜLHARDT 2002)) und anfallende Pyrophosphate reduziert. Es konnte diesbezüglich gezeigt werden, dass die Polymerase sequenzunspezifisch an diese neu synthetisierten Produkte bindet (KAINZ 2000). Wenn große Mengen an neu synthetisierten Produkt anfallen, ist die Wahrscheinlichkeit eines Reannealings des neu synthetisierten Produktes größer, als das Annealing zwischen DNAStrang und Primern. Dies wiederum senkt die Effektivität der PCR. Als zweites kommt es zur Zerstörung der Polymerase sowie der dNTPs durch wiederholt hohe Temperaturen während des Denaturierungsschritts. Auch werden im Verlauf der Reaktion dNTPs und Primer durch [Einbau in neusynthetisierte Produkte verbraucht. Diese Reduktion von Reaktionsprodukten führt ebenfalls zum Rückgang der Vermehrungsrate der PCR (KAINZ 2000).]


KAINZ P. (2000) : The PCR plateau phase - towards an understanding of its limitations. Biochim. Biophys. Acta ,1494, 23-7

Tatsächlich liegt der durchschnittliche

[Seite 17]

Multiplikationsfaktor (bezogen auf die Gesamtreaktion) je Zyklus bei ca. 1,6 bis 1,7 (KAINZ 2000). Dies liegt daran, dass die Vermehrungsrate am Ende der PCR geringer ist, als in der Mitte der Zyklenanzahl (Abb. 2.4). Zu Beginn und in der Mitte der Reaktion ist der Multiplikationsfaktor 2 und die Vermehrungsrate ist exponentiell. Gegen Ende geht die Reaktion in eine lineare und schließlich in eine Plateau-Phase über (Abb. 2.4; KAINZ 2000).

[Seite 18]

Ad 58a source.png

Abbildung 2-4: [...]

Das Phänomen der Verringerung der Vermehrungsrate während einer PCR hat mehrere Ursachen. So wird zum einen die Aktivität der Polymerase durch die Bindung an neu synthetisierte Produkte (ab einer Konzentration von ca. 0,3-1 pmol; MÜLHARDT 2002) und anfallende Pyrophosphate reduziert. Es konnte diesbezüglich gezeigt werden, dass die Polymerase sequenzunspezifisch an diese neu synthetisierten Produkte bindet (KAINZ 2000). Wenn große Mengen an neu synthetisierten Produkt anfallen, ist die Wahrscheinlichkeit eines Reannealings des neu synthetisierten Produktes größer, als das Annealing zwischen DNAStrang und Primern. Dies wiederum senkt die Effektivität der PCR. Als zweites kommt es zur Zerstörung der Polymerase sowie der dNTPs durch wiederholt hohe Temperaturen während des Denaturierungsschritts. Auch werden im Verlauf der Reaktion dNTPs und Primer durch Einbau in neusynthetisierte Produkte verbraucht. Diese Reduktion von Reaktionsprodukten führt ebenfalls zum Rückgang der Vermehrungsrate der PCR (KAINZ 2000).


KAINZ P. (2000): The PCR plateau phase - towards an understanding of its limitations. Biochim Biophys Acta, 1494, 23-7.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Interessanterweise enthält die Publikation Kainz (2000) keine Abbildung, die der Abbildung 3 bei Ad (oder auch der Abbildung 2-4 bei Bente (2003)) in irgendeiner Weise ähnlich ist.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[4.] Ad/Fragment 059 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 09:19:06 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 59, Zeilen: 1-13
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 18, 19, Zeilen: 18: 10 ff.; 19: 1 ff.
[Auch werden im Verlauf der Reaktion dNTPs und Primer durch] Einbau in neusynthetisierte Produkte verbraucht. Diese Reduktion von Reaktionsprodukten führt ebenfalls zum Rückgang der Vermehrungsrate der PCR (KAINZ 2000). Soll RNA in der PCR amplifiziert werden, muss mit dem Enzym Reverse Transkriptase (RNA-ahängige-DNA-Polymerase) zuerst eine komplementäre DNA synthetisiert werden, da RNA nicht als Matrize für die Polymerase geeignet ist. Die dabei entstehenden RNA-DNA-Heteroduplexe dienen als Ausgangsmatrize für eine Amplifikation mittels PCR. Als Primer für die Reverse Transkription kann man Oligo-dT-Primer, Hexamere oder spezifische Primer verwenden („spezifisches Priming“). Bei den Oligo-dT-Primern handelt es sich um kurze Nukleotide, die ausschließlich aus der Base Thymidin bestehen. Sie binden an den Poly-A-Schwanz von zellulären mRNAs und ermöglichen so eine gezielte Amplifikation der mRNAs. Die Reverse Transkription (cDNA-Synthese) ist ein wichtiger Teilschritt in der Amplifizierung der gewünschten Zielsequenz. Die Effizienz der cDNASynthese liegt zwischen 5 und 90 %, je nach Optimierung des Protokolls im Labor (RAPPOLEE 1990). Auch werden im Verlauf der Reaktion dNTPs und Primer durch Einbau in neusynthetisierte Produkte verbraucht. Diese Reduktion von Reaktionsprodukten führt ebenfalls zum Rückgang der Vermehrungsrate der PCR (KAINZ 2000).

[Seite 19]

Soll RNA in der PCR amplifiziert werden, muss mit dem Enzym Reverse Transkriptase (RNA-ahängige-DNA-Polymerase) zuerst eine komplementäre DNA synthetisiert werden, da RNA nicht als Matrize für die Polymerase geeignet ist (KAWASAKI 1989). Die dabei entstehenden RNA-DNA-Heteroduplexe dienen als Ausgangsmatrize für eine Amplifikation mittels PCR. Als Primer für die Reverse Transkription kann man Oligo-dT-Primer, Hexamere oder spezifische Primer verwenden („spezifisches Priming“). Bei den Oligo-dT-Primern handelt es sich um kurze Nukleotide, die ausschließlich aus der Base Thymidin bestehen. Sie binden an den Poly-A-Schwanz von zellulären mRNAs und ermöglichen so eine gezielte Amplifikation der mRNAs. Die Reverse Transkription (cDNA-Synthese) ist ein wichtiger Teilschritt in der Amplifizierung der gewünschten Zielsequenz. Die Effizienz der cDNASynthese liegt zwischen 5 und 90 %, je nach Optimierung des Protokolls im Labor (RAPPOLEE 1990).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[5.] Ad/Fragment 061 24 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 09:23:30 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 61, Zeilen: 24-31
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 19, Zeilen: 26 ff.
Eine Quantifizierung der Ausgangsmenge an RNA bzw. DNA kann nach einer PCR durch die Bestimmung der Dicke der Banden im Agarose-Gel erfolgen. Diese Extrapolation ist nicht in jedem Fall korrekt. Es handelt sich hierbei um die Endpunktbetrachtung einer PCR. Die Kinetik der Reaktion (z.B. Variationen der Effektivität) wird dabei nicht beachtet. Die Effektivität kann durch unterschiedliche Faktoren beeinflusst werden wie z.B. Primer- und Pufferkonzentrationen. Auch der Zeitpunkt der Durchführung kann eine Rolle spielen. Variationen in der Qualität und in den Volumina der einzelnen Reaktionskomponenten (bedingt durch Pipettierfehler), sowie Variationen im Temperaturprofil des Thermocycler [führen zu einer Variation der Effektivität der PCR von Lauf zu Lauf.] Eine Quantifizierung der Ausgangsmenge an RNA bzw. DNA kann nach einer PCR durch die Bestimmung der Dicke der Banden im Agarose-Gel erfolgen. Diese Extrapolation ist nicht in jedem Fall korrekt. Es handelt sich hierbei um die Endpunktbetrachtung einer PCR. Die Kinetik der Reaktion (z.B. Variationen der Effektivität) wird dabei nicht beachtet. Die Effektivität kann durch unterschiedliche Faktoren beeinflusst werden: wie z.B. Primer- und Pufferkonzentrationen. Auch der Zeitpunkt der Durchführung kann eine Rolle spielen. Variationen in der Qualität und in den Volumina der einzelnen Reaktionskomponenten (bedingt durch Pipettierfehler), sowie Variationen im Temperaturprofil des Thermocyclers, führen zu einer Variation der Effektivität der PCR von Lauf-zu-Lauf.
Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[6.] Ad/Fragment 062 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 09:40:19 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 62, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 19 f., Zeilen: 19: 32 ff.; 20: 1 ff.
[Variationen in der Qualität und in den Volumina der einzelnen Reaktionskomponenten (bedingt durch Pipettierfehler), sowie Variationen im Temperaturprofil des Thermocyclers,] führen zu einer Variation der Effektivität der PCR von Lauf zu Lauf. Daher ist es durchaus möglich, dass eine Probe A mit einer geringeren Menge an Nukleinsäure aufgrund einer höheren Effektivität der PCR als Probe B bei der Auswertung eine stärkere Bande zeigt als Probe B (Abbildung 4).

Ad 62a diss.png

Abbildung 4: Problem der Endpunktquantifizierung in der PCR: Trotz einer größeren Menge an Ausgangsnukleinsäure wird am Ende der PCR für Probe B eine schwächere Bande im Agarose-Gel sichtbar als für Probe A.

Eine nahezu korrekte Quantifizierung der Ausgangsmenge ist daher nur in einer real-time Auswertung möglich, da die Kinetik der PCR hier direkt verfolgbar ist.

Variationen in der Qualität und in den Volumina der einzelnen Reaktionskomponenten (bedingt durch Pipettierfehler), sowie Variationen im Temperaturprofil des Thermocyclers, führen zu einer Variation der Effektivität der PCR von Lauf-zu-Lauf. Daher ist es durchaus möglich, dass eine Probe A mit einer geringeren Menge an Nukleinsäure aufgrund einer höheren Effektivität der PCR als Probe B bei der Auswertung eine stärkere Bande zeigt als Probe B (Abb. 2.5).

[Seite 20]

Ad 62a source.png

Abbildung 2-5: Problem der Endpunktquantifizierung in der PCR: Trotz einer größeren Menge an Ausgangsnukleinsäure wird am Ende der PCR für Probe B eine schwächere Bande im Agarose-Gel sichtbar als für Probe A.

Eine nahezu korrekte Quantifizierung der Ausgangsmenge ist daher nur in einer real-time Auswertung (vgl.2.3.8) möglich, da die Kinetik der PCR hier verfolgbar ist.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[7.] Ad/Fragment 063 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-10 14:21:10 Schumann
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 63, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 35, Zeilen: 1 ff.
2.16.4 Quantitative real-time Polymerasekettenreaktion (QRT-PCR)

Einleitung

Die quantitative real-time PCR ist eine relativ neue Technik, die zu Beginn der 1990er Jahre entwickelt wurde und seit ca. acht Jahren für den kommerziellen Markt verfügbar ist. Einen starken Anstieg der Nutzung dieser Methode gab es in den letzten drei Jahren. Während die Anzahl der Veröffentlichungen in der internationalen Datenbank Medline 1996 19, 1997 28 und 1998 52 betrug, stieg die Zahl 1999 auf 157, 2000 auf 409 und im Jahre 2001 sogar auf 551 (SCHMITTGEN 2001). Die Technologie kombiniert die DNA Amplifikation (PCR) mit der Detektion des Produktes in einem einzigen Reaktionsgefäß vom Ansatz bis zur Auswertung. Durch das Wegfallen der zeitaufwendigen Auswertung mittels Agarose- Gelelektrophorese bietet diese Methode ferner eine beachtliche Zeitersparnis. Bei der Entwicklung dieser Technik war die Grundidee der Versuch, die Amplifikation des PCR Produktes „live“ zu beobachten. Die ersten Ansätze bestanden darin, die PCR alle fünf Zyklen zu stoppen, ein Aliquot zu entnehmen und auszuwerten (GINZINGER 2001). Dieser Ansatz war, insbesondere bei hohem Probenaufkommen, sehr zeit- und arbeitsaufwendig und barg zudem ein hohes Kontaminationsrisko. Weiterführende Arbeiten beschäftigten sich mit der Markierung der DNA-Fragmente während der Reaktion. Anfang der 1990er wurde festgestellt, dass man über die 5` - 3`Exonuklease Aktivität der Taq-Polymerase eine indirekte Aussage über die Zunahme der Amplifikate während der PCR machen kann. Zu diesem Zweck wurden radioaktiv markierte Sonden verwendet, die mit den Amplifikaten hybridisierten und durch die Taq-Polymerase enzymatisch gespalten wurden (HOLLAND et al. 1991). Vier Jahre später konnten die radioaktiv markierten Sonden durch Fluorochrom-markierte Sonden ersetzt werden (LEE et al. 1995). Zur selben Zeit zeigte eine andere Forscher, dass auch eine direkte Messung der entstehenden Produkte während der PCR mittels Verwendung interkalierender Farbstoffe möglich ist (HIGUCHI et al.1992, 1993). Bei beiden Entwicklungen erfolgte die Auswertung durch Messung der Fluoreszenz vor und nach der PCR-Reaktion in einem separaten Gefäß. Durch die Kombination eines Thermocyclers mit einer Lichtquelle in Form einer Halogenlampe, eines Lasers oder LEDs (Licht emittierende Diode) sowie eines optischen Detektionsmoduls, konnte nur wenige Jahre später, die Fluoreszenz auch während der laufenden PCR gemessen werden. Eine Auswertung in [Echtzeit (engl.: real-time) war nun möglich (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al.1997).]


SCHMITTGEN TD. (2001) : Real-time quantitative PCR. Methods ,253, 83-5

[...]

2.3 Quantitative real-time Polymerasekettenreaktion (QRT-PCR)

2.3.1 Einleitung

Die quantitative real-time PCR ist eine relativ neue Technik, die zu Beginn der 1990er Jahre entwickelt wurde und seit ca. sechs Jahren für den kommerziellen Markt verfügbar ist. Einen starken Anstieg der Nutzung dieser Methode gab es in den letzten drei Jahren. Während die Anzahl der Veröffentlichungen in der internationalen Datenbank Medline 1996 19, 1997 28 und 1998 52 betrug, stieg die Zahl 1999 auf 157, 2000 auf 409 und im Jahre 2001 sogar auf 551 (SCHMITTGEN 2002). Die Technologie kombiniert die DNA Amplifikation (PCR) mit der Detektion des Produktes in einem einzigen Reaktionsgefäß vom Ansatz bis zur Auswertung. Durch das Wegfallen der zeitaufwendigen Auswertung mittels Agarose- Gelelektrophorese bietet diese Methode ferner eine erhöhte Zeitersparnis. Bei der Entwicklung dieser Technik war die Grundidee der Versuch, die Amplifikation des PCR-Produktes „live“ zu beobachten. Die ersten Ansätze bestanden darin, die PCR alle fünf Zyklen zu stoppen, ein Aliquot zu entnehmen und auszuwerten (GINZINGER 2001). Dieser Ansatz war, insbesondere bei hohem Probenaufkommen, sehr zeit- und arbeitsaufwendig und barg zudem ein hohes Kontaminationsrisko. Weiterführende Arbeiten beschäftigten sich mit der Markierung der DNA-Fragmente während der Reaktion. Anfang der 1990er wurde festgestellt, dass man über die 5` - 3`Exonuklease Aktivität der Taq-Polymerase eine indirekte Aussage über die Zunahme der Amplifikate während der PCR machen kann. Zu die Zweck wurden radioaktiv markierte Sonden verwendet, die mit den Amplifikaten hybridisierten und durch die Taq-Polymerase enzymatisch gespalten wurden (HOLLAND et al. 1991). Vier Jahre später konnten die radioaktiv markierten Sonden durch Fluorochrom-markierte Sonden ersetzt werden (LEE et al. 1995). Zur selben Zeit zeigte eine andere Forschungsgruppe, dass auch eine direkte Messung der entstehenden Produkte während der PCR mittels Verwendung interkalierender Farbstoffe möglich ist (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Bei beiden Entwicklungen erfolgte die Auswertung durch Messung der Fluoreszenz vor und nach der PCR-Reaktion in einem separaten Gefäß. Durch die Kombination eines Thermocyclers mit einer Lichtquelle in Form einer Halogenlampe, eines Lasers oder LEDs (Licht emittierende Diode) sowie eines optischen Detektionsmoduls, konnte nur wenige Jahre später, die Fluoreszenz auch während der laufenden PCR gemessen werden. Eine Auswertung in Echtzeit (engl.: real-time) war nun möglich (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al. 1997).


SCHMITTGEN T. D. (2001): Real-time quantitative PCR. Methods, 25, 383-5.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Die Eigenleistung beschränkt sich auf eine Aktualisierung ("seit ca. 8 Jahren" statt "seit ca. sechs Jahren") und die Korrektur einer Quellenangabe.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[8.] Ad/Fragment 064 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 09:57:13 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 64, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 35, 36, 38, Zeilen: 35: 30 ff.; 36: 1 ff.; 38: 11 ff.
[Eine Auswertung in] Echtzeit (engl.: real-time) war nun möglich (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al.1997). Die Visualisierung des Amplikons ist grundsätzlich mit zwei verschiedenen Fluoreszenzdetektionssystemen möglich: Einem nicht spezifischen Detektionssystem, welches auf der Markierung des Amplikons durch interkalierende Farbstoffe basiert, und einem spezifischen Detektionssystem, das fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet. Beide Detektionsmethoden beruhen auf der Tatsache, dass der Anstieg der Fluoreszenz proportional zum Anstieg der Konzentration des Amplifikationsproduktes ist. Aufgrund einer Proportionalität der Fluoreszenz und der entstehenden Amplifikate ist zudem eine Quantifizierung der Ausgangs-DNA möglich. Die während des Amplifikationsprozesses emittierte Fluoreszenz wird während jedes PCR-Zyklus gemessen und ermöglicht so eine graphische Darstellung der Amplifikation, die es dem Anwender erlaubt, die Reaktion in Echtzeit zu beobachten. Da sich die Kinetik der PCR-Reaktion beobachten lässt, wird manchmal auch der Begriff kinetische PCR verwendet (WALKER 2002; LEUTENEGGER 2001).

Detektionssystem mit interkalierenden Farbstoffen

Interkalierende Farbstoffe waren der erste Entwicklungsschritt zur Visualisierung des entstehenden Amplikons (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Sie emittieren, nach Anregung durch energiereiches UV-Licht, Licht im sichtbaren energieärmeren Wellenlängenbereich (Fluoreszenz). Liegt der Farbstoff frei vor, ist die Emission sehr gering. Erst durch die Interkalierung des Farbstoffs in die kleine Windung der doppelsträngigen DNA wird die Lichtemission verstärkt (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Die Fähigkeit des Farbstoffs zur Einlagerung in die kleinen Windungen der DNA ist auf seinen planaren Molekülaufbau zurückzuführen (Abb.5). Der für diese Zwecke als erstes genutzte Farbstoff war Ethidiumbromid. Inzwischen ist dieser Farbstoff von anderen Farbstoffen wie z.B. Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR Green™ (MOLECULAR PROBES INC.) aufgrund eines besseren Signal-Hintergrund-Verhältnisses ersetzt worden. Der am meisten verwendete Farbstoff ist SYBR Green™, der eine Anregungswellenlänge von 497 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm besitzt (HIGUCHI et al. 1992, 1993).

Eine Auswertung in Echtzeit (engl.: real-time) war nun möglich (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al. 1997).

Die Visualisierung des Amplikons ist grundsätzlich mit zwei verschiedenen Fluoreszenzdetektionssystemen möglich: einem nichtspezifisches Detektionssystem, welches auf der Markierung des Amplikons durch interkalierende Farbstoffe basiert, und einem spezifisches Detektionssystem, das fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet. Beide Detektionsmethoden beruhen auf der Tatsache, dass der Anstieg der Fluoreszenz proportional zum Anstieg der Konzentration des Amplifikationsproduktes ist. Aufgrund einer

[Seite 36:]

Proportionalität der Fluoreszenz und der entstehenden Amplifikate ist zudem eine Quantifizierung der Ausgangs-DNA möglich. Die während des Amplifikationsprozesses emittierte Fluoreszenz wird während jedes PCR-Zyklus gemessen und ermöglicht so eine graphische Darstellung der Amplifikation, die es dem Anwender erlaubt, die Reaktion in Echtzeit zu beobachten. Da sich die Kinetik der PCR-Reaktion beobachten lässt, wird manchmal auch der Begriff kinetische PCR verwendet (WALKER 2002; LEUTENEGGER 2001).

[Seite 38:]

2.3.3.1 Interkalierende Farbstoffe

Interkalierende Farbstoffe waren der erste Entwicklungsschritt zur Visualisierung des entstehenden Amplikons (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Sie emittieren, nach Anregung durch energiereiches UV-Licht, Licht im sichtbaren energieärmeren Wellenlängenbereich (Fluoreszenz). Liegt der Farbstoff frei vor, ist die Emission sehr gering. Erst durch die Interkalierung des Farbstoffs in die kleine Windung der doppelsträngigen DNA wird die Lichtemission stark verstärkt (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Die Fähigkeit des Farbstoffs zur Einlagerung in die kleinen Windungen der DNA ist auf seinen planaren Molekülaufbau zurückzuführen (Abb. 2.6). Der für diese Zwecke als erstes genutzte Farbstoff war Ethidiumbromid. Inzwischen ist dieser Farbstoff von anderen Farbstoffen wie z.B. Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR Green™ (MOLECULAR PROBES INC.) aufgrund eines besseren Signal-Hintergrund-Verhältnisses ersetzt worden. Der am meisten verwendete Farbstoff ist SYBR Green™, der eine Anregungswellenlänge von 497 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm besitzt (HIGUCHI et al. 1992, 1993).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[9.] Ad/Fragment 065 02 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 10:04:04 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 65, Zeilen: 1-21
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 39, Zeilen: 1 ff.
[ABBILDUNG]

Die Vorteile dieser Farbstoffe sind, dass sie preisgünstig sind und eine universelle Verwendbarkeit haben, da mit ihnen prinzipiell jede PCR verfolgt werden kann (BUSTIN 2000). Außerdem haben sie eine hohe Signalstärke, weil jedes DNA-Molekül mehrere Farbstoffmoleküle bindet. Aus den Vorteilen resultiert aber auch ein großer Nachteil: Durch diese Farbstoffe kann man prinzipiell nicht zwischen korrektem Produkt und Artefakten (wie z.B. Primerdimern) unterscheiden. Entstehende Primerdimer und andere Artefakte binden ebenfalls SYBR Green™ und führen somit zu einem unspezifischen Anstieg der Fluoreszenz auch in negativen Proben (VANDESOMPELE et al. 2002). Eine klare Differenzierung zwischen Primerdimer bzw. Artefakt und Zielfragment ist daher zwingend notwendig (VANDESOMPELE et al. 2002).

Diesem Umstand wurde bei den interkalierenden Farbstoffen mit Hilfe der Schmelzpunktanalyse entgegen gewirkt (Abb.6): Dazu wird eine Schmelzpunktanalyse des Produkts am Ende der eigentlichen PCR durchgeführt (RIRIE et al. 1997). Das Reaktionsgemisch wird dabei in 1 °C Schritten von 50 °C auf 95 °C erhitzt und kontinuierlich die Fluoreszenz gemessen. Der Punkt, an dem doppelsträngige DNA schmilzt, ist durch einen Abfall (Peak) der Fluoreszenz des interkalierenden Farbstoffes gekennzeichnet, da der interkalierenden Farbstoff von der einzelsträngigen DNA dissoziiert (Abb.6). Wenn die PCR optimal eingestellt ist, sollte ein Schmelzpunktpeak zu erwarten sein, der spitz zuläuft. Dieser Schmelzpunkt stellt das spezifische, zu erwartende Produkt dar. Unterschiedlich große Produkte und Produkte anderer Sequenz haben unterschiedliche Schmelzpunkte (Abbildung 6). Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur grafisch auf, so kann man den [Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen (Abbildung 6).]

Die Vorteile dieser Farbstoffe sind, dass sie preisgünstig sind und eine universelle Verwendbarkeit haben, da mit ihnen prinzipiell jede PCR verfolgt werden kann (BUSTIN 2000). Außerdem haben sie eine hohe Signalstärke, weil jedes DNA-Molekül mehrere Farbstoffmoleküle bindet. Aus den Vorteilen resultiert aber auch ein großer Nachteil: Durch diese Farbstoffe kann man prinzipiell nicht zwischen korrektem Produkt und Artefakten (wie z.B. Primerdimern) unterscheiden. Entstehende Primerdimer und andere Artefakte binden ebenfalls SYBR Green™ und führen somit zu einem unspezifischen Anstieg der Fluoreszenz auch in negativen Proben (VANDESOMPELE et al. 2002). Eine klare Differenzierung zwischen Primerdimer bzw. Artefakt und Zielfragment ist daher zwingend notwendig (VANDESOMPELE et al. 2002).

Diesem Umstand wurde bei den interkalierenden Farbstoffen mit Hilfe der Schmelzpunktanalyse entgegen gewirkt (Abb. 2.7): Dazu wird eine Schmelzpunktanalyse des Produkts am Ende der eigentlichen PCR durchgeführt (RIRIE et al. 1997). Das Reaktionsgemisch wird dabei in 1 °C Schritten von 50 °C auf 95 °C erhitzt und kontinuierlich die Fluoreszenz gemessen. Der Punkt, an dem doppelsträngige DNA schmilzt, ist durch einen Abfall (Peak) der Fluoreszenz des interkalierenden Farbstoffes gekennzeichnet, da der interkalierenden Farbstoff von der einzelsträngigen DNA dissoziiert (Abb. 2.7, 2). Wenn die PCR optimal eingestellt ist, sollte ein Schmelzpunktpeak zu erwarten sein, der spitz zuläuft. Dieser Schmelzpunkt stellt das spezifische, zu erwartende Produkt dar. Unterschiedlich große Produkte und Produkte anderer Sequenz haben unterschiedliche Schmelzpunkte (Abb. 2.7, 2). Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur graphisch auf, so kann man den Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen (Abb. 2.7, 1).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Die Abbildung am Anfang der Seite stammt nicht aus der hier dokumentierten Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[10.] Ad/Fragment 066 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 10:14:03 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 66, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 39, 40, 52, Zeilen: 39: 21 ff.; 40: 1 ff.; 52: 34ff
[Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur grafisch auf, so kann man den] Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen (Abbildung 6). Damit gewinnt dieses System an Spezifität und erlaubt es, ein spezifisches Produkt von Artefakten zu unterscheiden (RIRIE et al. 1997).

Andererseits ist eine Quantifizierung mittels eines SYBR Green™ Protokolls nur dann möglich, wenn es keine Artefakte oder Primerdimer gibt.

Ad 66a diss.png

Abbildung 6: Darstellung einer Schmelzpunktanalyse

Nach der eigentlichen PCR wird das Produkt von 50 °C an in 1 °C Temperaturschritten für jeweils 30 sek bis zu einer Endtemperatur von 95 °C erhitzt. Bei einer für das Produkt spezifischen Temperatur denaturiert der Doppelstrang. Es kommt zu einem Abfall der Fluoreszenz (Peak) 2. Die zwei PCR-Produkte (A,B) mit unterschiedlicher Länge schmelzen bei unterschiedlichen Temperaturen.

Auswertung der quantitativen real-time Polymerasekettenreaktion

Die real-time PCR ermöglicht eine zeitgleiche Auswertung der Reaktion während des eigentlichen Amplifikationsprozesses. Die Auswertung erfolgt in der real-time RT-PCR durch die Messung der emittierten Fluoreszenz eines Farbstoffs. Emittierte Fluoreszenz und [entstehendes Amplifikat sind linear proportional.]

Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur graphisch auf, so kann man den Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen (Abb. 2.7, 1). Damit gewinnt dieses System an Spezifität und erlaubt es, ein spezifisches Produkt von Artefakten zu unterscheiden (RIRIE et al. 1997). [...] Andererseits ist eine Quantifizierung mittels eines SYBR Green™ Protokolls nur dann möglich, wenn es keine Artefakte oder Primerdimer gibt.

[Seite 40:]

Ad 66a source.png

Abbildung 2-8: 1. Darstellung einer Schmelzpunktanalyse: Nach der eigentlichen PCR wird das Produkt von 50 °C an in 1 °C Temperaturschritten für jeweils 30 sek bis zu einer Endtemperatur von 95 °C erhitzt. Bei einer für das Produkt spezifischen Temperatur denautriert [sic] der Doppelstrang. Es kommt zu einem Abfall der Fluoreszenz (Peak) 2. Die zwei PCR-Produkte (A,B) mit unterschiedlicher Länge schmelzen bei unterschiedlichen Temperaturen.

[Seite 52:]

2.3.6 Auswertung

Die real-time PCR ermöglicht eine zeitgleiche Auswertung der Reaktion während des eigentlichen Amplifikationsprozesses. Die Auswertung erfolgt in der real-time RT-PCR durch die Messung der emittierten Fluoreszenz eines Farbstoffs. Emittierte Fluoreszenz und entstehendes Amplifikat sind linear proportional.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[11.] Ad/Fragment 067 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 12:05:19 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 67, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 52, 53, Zeilen: 52 letzte 4 Zeilen; 53 : 1 ff.
[Die Auswertung erfolgt in der real-time RT-PCR durch die Messung der emittierten Fluoreszenz eines Farbstoffs. Emittierte Fluoreszenz und] entstehendes Amplifikat sind linear proportional. Durch diese Verhältnismäßigkeit lässt sich über die Messung der Fluoreszenz auf die entstehende Menge an Produkt schließen.

Grundsätzlich lassen sich zwei Auswertungsmöglichkeiten bei real-time PCR-Systemen unterscheiden: Die Endpunktmessung und die Echtzeitmessung. Bei der Endpunktmessung, die alle zurzeit erhältlichen Geräte anbieten, werden die Fluoreszenzwerte der Probe zu Beginn (bei einigen Geräten auch zusätzlich einmal in der Mitte der Zyklenanzahl) und am Ende gemessen. Mit dieser Art der Messung ist nur eine qualitative Aussage (Ja/Nein- Aussage) möglich, da nur ermittelt wird, ob es während der PCR-Reaktion zu einem Anstieg der Fluoreszenz gekommen ist. Eine Beobachtung der Ergebnisse während des Amplifikationsprozesses und eine Quantifizierung sind hier nicht möglich.

Bei der Echtzeitmessung wird die Fluoreszenz während jedes einzelnen Zyklus gemessen. Die während des Amplifikationsprozesses gemessene native Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs wird als R bezeichnet. Wird die gemessene Fluoreszenz um den Fluoreszenzwert der Basislinie korrigiert, so wird dieser Wert als dR bezeichnet (Tab.3). Des Weiteren besteht die Möglichkeit, die gemessene Fluoreszenz mit der Fluoreszenz eines Referenzfarbstoffes abzugleichen (Rn). Der Referenzfarbstoff –meist ROX oder HEX– ist ein fluoreszierender Farbstoff, der allen Reaktionsansätzen in konstanter Menge zugegeben wird. Er dient zur Abgleichung möglicher Fluoreszenzunterschiede der Sonde, die aufgrund von unterschiedlichen Volumina (Pipettierfehlern) in den einzelnen Reaktionsgefäßen entstehen. Des Weiteren dient der Referenzfarbstoff zum Abgleich variierender Fluoreszenzwerte, die dadurch entstehen, dass die optische Detektionseinheit von Reaktionsgefäß zu Reaktionsgefäß fährt und so unterschiedliche Aberrationen des Lichtes entstehen können. Wird die gemessene Fluoreszenz mit Basislinie und Referenzfarbstoff korrigiert, so entsteht der Wert dRn (Tab.3).

Ad 67a diss.png

Tabelle 2: Die während einer real-time PCR gemessene native Fluoreszenz (RReporter) wird im Folgenden an die Fluoreszenz der Basislinie und der des Referenzfarbstoffs angepasst.

Das real-time System erzeugt aus den ermittelten Fluoreszenzwerten eine grafische Darstellung, die als Amplifikationsgrafik bezeichnet wird.

Die Auswertung erfolgt in der real-time RT-PCR durch die Messung der emittierten Fluoreszenz eines Farbstoffs. Emittierte Fluoreszenz und entstehendes Amplifikat sind linear proportional. Durch diese Verhältnismäßigkeit lässt sich über die Messung der Fluoreszenz auf die entstehende Menge an Produkt schließen.

[Seite 53]

Grundsätzlich lassen sich zwei Auswertungsmöglichkeiten bei real-time PCR-Systemen unterscheiden: Die Endpunktmessung und die Echtzeitmessung. Bei der Endpunktmessung, die alle zurzeit erhältlichen Geräte anbieten, werden die Fluoreszenzwerte der Probe zu Beginn (bei einigen Geräten auch zusätzlich einmal in der Mitte der Zyklenanzahl) und am Ende gemessen. Mit dieser Art der Messung ist nur eine qualitative Aussage (Ja/Nein- Aussage) möglich, da nur ermittelt wird, ob es während der PCR-Reaktion zu einem Anstieg der Fluoreszenz gekommen ist. Eine Beobachtung der Ergebnisse während des Amplifikationsprozesses und eine Quantifizierung sind hier nicht möglich.

Bei der Echtzeitmessung wird die Fluoreszenz während jedes einzelnen Zyklus gemessen. Ob Annealing- oder Elongationsschritt als Zeitpunkt der Messung definiert werden, ist von der Sondenart abhängig.

Die während des Amplifikationsprozesses gemessene native Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs wird als R bezeichnet. Wird die gemessene Fluoreszenz um den Fluoreszenzwert der Basislinie korrigiert, so wird dieser Wert als dR bezeichnet (Abb. 2.15). Des Weiteren besteht die Möglichkeit, die gemessene Fluoreszenz mit der Fluoreszenz eines Referenzfarbstoffes abzugleichen (Rn). Der Referenzfarbstoff –meist ROX oder HEX– ist ein fluoreszierender Farbstoff, der allen Reaktionsansätzen in konstanter Menge zugegeben wird. Er dient zur Abgleichung möglicher Fluoreszenzunterschiede der Sonde, die aufgrund von unterschiedlichen Volumina (Pipettierfehlern) in den einzelnen Reaktionsgefäßen entstehen. Des Weiteren dient der Referenzfarbstoff zum Abgleich variierender Fluoreszenzwerte, die dadurch entstehen, dass die optische Detektionseinheit von Reaktionsgefäß zu Reaktionsgefäß fährt und so unterschiedliche Aberrationen des Lichtes entstehen können. Wird die gemessene Fluoreszenz mit Basislinie und Referenzfarbstoff korrigiert, so entsteht der Wert dRn (Abb. 2.16).

Ad 67a source.png

Abbildung 2-16: Die während einer real-time PCR gemessene native Fluoreszenz (RReporter ) wird im Folgenden an die Fluoreszenz der Basislinie und der des Referenzfarbstoffs angepasst

Das real-time System erzeugt aus den ermittelten Fluoreszenzwerten eine graphische Darstellung, die als Amplifikationsgrafik bezeichnet wird.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[12.] Ad/Fragment 068 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 12:08:32 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 68, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 53, 54, 55, Zeilen: 53 unten; 54: 1 ff.; 55: 1 ff.
[Zur veranschaulichenden] Darstellung wird die gemessene Fluoreszenz auf der Ordinate gegen die Zyklenanzahl, auf der Abszisse aufgetragen (Abb.7)

Ad 68a diss.png

Abbildung 7: Darstellung einer Amplifikationsgrafik.

Die gemessene Fluoreszenz (Ordinate) wird gegen die Zyklenzahl (Abszisse) aufgetragen. Dabei zeigt der Reaktionsansatz schon eine gewisse Grundfluoreszenz (GF), bevor es zur Amplifikation gekommen ist. Aus der Standardabweichung der Fluoreszenz zwischen Zyklus 3 und 15 multipliziert mit dem Faktor zehn, wird ein Fluoreszenzwert errechnet, der zur Grundfluoreszenz der Proben addiert wird. So ergibt sich der Schwellenwert (Threshold). Der Schnittpunkt zwischen Amplifikationsgraph und Schwellenwert wird als Cycle-threshold (CT) bezeichnet. Er markiert einen Anstieg der Fluoreszenz über den Schwellenwert.

Die bei der real-time PCR eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe weisen eine gewisse Grundfluoreszenz auf. Ferner haben auch die verschiedenen verwendeten Materialien, wie z.B. die Plastikreaktionsgefäße, bei Anregung eine gewisse Hintergrundfluoreszenz. Der Fluoreszenzwert, gemessen beim Start der Reaktion, ist daher nicht gleich Null. Im Falle einer negativen QRT-PCR verbleibt die gemessene Fluoreszenz unter dem Schwellenwert und verläuft in einer geraden Linie bis zum Ende (Tabelle 2). Im Falle einer positiven Reaktion kommt es zur Amplifikation des Produkts und damit zum Anstieg der Fluoreszenz im Laufe der Reaktion.

Vor dem Anstieg der Fluoreszenz verbleibt die gemessene Fluoreszenz für eine gewisse Anzahl an Zyklen unverändert und verläuft als gerade Linie parallel zur Abszisse. Dieser Bereich wird als Basislinie bezeichnet. In diesem Bereich der PCR kommt es zwar schon zur Produktsynthese, die entstehenden Produktmengen sind jedoch so gering, dass es noch nicht zum Anstieg der meßbaren Fluoreszenz kommt (Abb. 8).

Zur veranschaulichenden Darstellung wird die gemessene Fluoreszenz auf der Ordinate gegen die Zyklenanzahl, auf der Abzisse aufgetragen (Abb. 2.16).

[Seite 54:]

Ad 68a source.png

Abbildung 2-17: Darstellung einer Amplifikationsgrafik: Die gemessene Fluoreszenz (Ordinate) wird gegen die Zyklenzahl (Abzisse) aufgetragen. Dabei zeigt der Reaktionsansatz schon eine gewisse Grundfluoreszenz (GF), bevor es zur Amplifikation gekommen ist. Aus der Standardabweichung der Fluoreszenz zwischen Zyklus 3 und 15 multipliziert mit dem Faktor zehn, wird ein Fluoreszenzwert errechnet, der zur Grundfluoreszenz der Proben addiert wird. So ergibt sich der Schwellenwert (Threshold). Der Schnittpunkt zwischen Amplifikationsgraph und Schwellenwert wird als Cycle-threshold (CT) bezeichnet. Er markiert einen Anstieg der Fluoreszenz über den Schwellenwert.

Die bei der real-time PCR eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe weisen eine gewisse Grundfluoreszenz auf. Ferner haben auch die verschiedenen verwendeten Materialien, wie z.B. die Plastikreaktionsgefäße, bei Anregung eine gewisse Hintergrundfluoreszenz. Der Fluoreszenzwert, gemessen beim Start der Reaktion, ist daher nicht gleich Null. Im Falle einer negativen QRT-PCR verbleibt die gemessene Fluoreszenz unter dem Schwellenwert und verläuft in einer geraden Linie bis zum Ende (Abb. 2.16). Im Falle einer positiven Reaktion kommt es zur Amplifikation des Produkts und damit zum Anstieg der Fluoreszenz im Laufe der Reaktion.

[Seite 55:]

Vor dem Anstieg der Fluoreszenz verbleibt die gemessene Fluoreszenz für eine gewisse Anzahl an Zyklen unverändert und verläuft als gerade Linie parallel zur Abzisse. Dieser Bereich wird als Basislinie bezeichnet. In diesem Bereich der PCR kommt es zwar schon zur Produktsynthese, die entstehenden Produktmengen sind jedoch so gering, dass es noch nicht zum Anstieg der Fluoreszenz kommt (Abb. 2.17).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[13.] Ad/Fragment 069 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 12:11:45 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 69, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 55, 56, 57, Zeilen: 55: 6ff; 56: 1ff; 57: 1ff
Ad 69a diss.png

Abbildung 8: Relation der gemessenen Fluoreszenz zum entstehenden Produkt in einer real-time PCR.

Während schon in den ersten Zyklen PCR-Produkte entstehen, reicht die dabei entstehende Fluoreszenz nicht aus, um ein messbares Signal zu erzeugen.

Im Bereich der Basislinie kommt es immer zu leichten Schwankungen in der gemessenen Fluoreszenz. Diese beruhen auf Schwankungen der Fluoreszenz in der Probe (Abb.7). Es muss nun ein Punkt definiert werden, ab dem eine gemessene Fluoreszenz einer Probe klar von der Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden und als positiv zu werten ist. Hierfür wird ein Schwellenwert gesetzt (Threshold; Abbildung 7). Er stellt eine Trennlinie zur Unterscheidung zwischen signifikanter Zunahme der Fluoreszenz und der Hintergrundfluoreszenz dar. Er wird definiert als die Standardabweichung der Hintergrundfluoreszenz -gemessen zwischen Zyklus drei und 15- multipliziert mit dem Faktor 10.

Der Schnittpunkt zwischen der Fluoreszenz und dem Schwellenwert projiziert auf die Abszisse wird als Zyklen-Schwellenwert (Cycle-threshold (CT)) bezeichnet und stellt den niedrigsten messbaren positiven Wert einer QRT-PCR dar. Der CT-Wert gibt also eine Zyklenanzahl an. Er steht in direkter Beziehung zur Ausgangsmenge der eingesetzten DNA. Ist der CT-Wert niedrig, ist die eingesetzte Menge DNA groß. Ist der CT-Wert hoch, so ist die Ausgangsmenge an DNA klein. Der CT-Wert ist daher Grundlage für die Quantifizierung einer Reaktion.

Quantifizierung

Die Quantitative PCR kann für verschiedene Anwendungen genutzt werden, wie z.B. das Monitoring der Genexpression oder die Bestimmung der Viruslast im Rahmen von [Pathogenesestudien (BUSTIN 2000; FREEMAN et al. 1999; HALFORD 1999; HEID et al. 1996).]

Ad 69a source.png

Abbildung 2-18: Relation der gemessenen Fluoreszenz zum entstehenden Produkt in einer real-time PCR.

Während schon in den ersten Zyklen PCR-Produkte entstehen, reicht die dabei entstehende Fluoreszenz nicht aus, um ein messbares Signal zu erzeugen.

Im Bereich der Basislinie kommt es immer zu leichten Schwankungen in der gemessenen Fluoreszenz. Diese beruht auf Schwankungen der Fluoreszenz in der Probe (Abb. 2.16). Es muss nun ein Punkt definiert werden, ab dem eine gemessene Fluoreszenz einer Probe klar von der Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden und als positiv zu werten ist. Hierfür wird ein Schwellenwert gesetzt (Threshold; Abb. 2.16). Er stellt eine Trennlinie zur Unterscheidung zwischen signifikanter Zunahme der Fluoreszenz und der

[Seite 56:]

Hintergrundfluoreszenz dar. Er wird definiert als die Standardabweichung der Hintergrundfluoreszenz -gemessen zwischen Zyklus drei und 15- multipliziert mit dem Faktor 10. Der Schnittpunkt zwischen der Fluoreszenz und dem Schwellenwert projiziert auf die Abzisse wird als Cycle-threshold (CT) bezeichnet und stellt den niedrigsten messbaren positiven Wert einer QRT-PCR dar. Der CT-Wert gibt also eine Zyklenanzahl an. Er steht in direkter Beziehung zur Ausgangsmenge der eingesetzten DNA. Ist der CT-Wert niedrig, ist die eingesetzte Menge DNA groß. Ist der CT-Wert hoch, so ist die Ausgangsmenge an DNA klein. Der CT-Wert ist daher Grundlage für die Quantifizierung einer Reaktion (vgl. 2.3.8).

[...]

2.3.8 Quantifizierung

Die Quantitative PCR kann für verschiedene Anwendungen genutzt werden, wie z.B. das Monitoring der Genexpression oder die Bestimmung der Viruslast im Rahmen von

[Seite 57:]

Pathogenesestudien (BUSTIN 2000, FREEMAN et al. 1999, HALFORD 1999, HEID et al. 1996).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[14.] Ad/Fragment 070 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-09 12:34:06 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 70, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 56, 57, 58, Zeilen: 56: letzte Zeilen; 57: 1 ff.; 58: 1 ff.
[Die Quantitative PCR kann für verschiedene Anwendungen genutzt werden, wie z.B. das Monitoring der Genexpression oder die Bestimmung der Viruslast im Rahmen von] Pathogenesestudien (BUSTIN 2000; FREEMAN et al. 1999; HALFORD 1999; HEID et al. 1996).

Das Prinzip der Quantifizierung der Ausgangsmenge an Nukleinsäure mittels real-time RTPCR unterscheidet sich grundlegend von der Quantifizierung mit Hilfe einer konventionellen RT-PCR, da hier nicht die absolute Menge an PCR-Produkt, das bis zum Ende der Reaktion entsteht, gemessen wird. Bei der QRT-PCR wird der CT-Wert genutzt. Der CT-Wert verhält sich umgekehrt proportional zum Logarithmus der Ausgangsmenge an Nukleinsäure (HIGUCHI et al. 1993). Rein theoretisch könnte anhand des CT-Wertes auf die ursprüngliche Matrizenmenge zurückgeschlossen werden, wenn gleichzeitig die Vermehrungsrate der PCR bekannt wäre. Die Amplifikation eines bestimmten Fragments wird aber von vielen Faktoren beeinflusst, so dass es nicht möglich ist, die genaue Vermehrungsrate einer Reaktion zu ermitteln (BUSTIN 2000). Es ist daher einfacher, parallel zu den zu untersuchenden Proben, Proben mit bekannter Menge in Form eines Standards zu amplifizieren und die so ermittelten CT-Werte miteinander zu vergleichen. Die Quantifizierung kann relativ oder absolut erfolgen. Dies beruht auf unterscheidlichen Prinzipien des verwendeten Standards.

Grundsätzlich gibt es zwei Arten der Berechnung der relativen Menge: Die Standardkurven- Methode und die ΔΔCt-Methode (LIVAK & SCHMITTGEN 2001).


Beide Berechnungsmethoden benötigen neben der eigentlichen Zielsequenz auch eine „endogene Kontrolle“ (Referenzgen), die mit amplifiziert wird. Somit lässt sich anhand der m-RNA des Referenzgens die relative Menge an m-RNA des Zielgenes in einer RT-PCR Probe bestimmen. Als endogene Kontrolle sollten Gene verwendet werden, die ubiquitär und in einer konstanten Menge in den verwendeten Zellen vorkommen wie z.B. 18s rRNA, GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase) oder β-Aktin. Sie sollten unter den verschieden experimentellen Bedingungen immer konstant exprimiert werden. Da 18s rRNA keinen Poly-A-Schwanz besitzt, kann sie nicht als endogene Kontrolle für eine RT-PCR eingesetzt werden, bei der Oligo-dTs für den Schritt der reversen Transkription verwendet werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass es zu einer unterschiedlichen Expression von Housekeeping Genen in Zellen kommen kann (LIVAK & SCHMITTGEN 2001). Die Verwendung z.B. von GAPDH ist daher kritisch zu sehen. β-Aktin stellt womöglich eine bessere Alternative dar. Vorab sollte immer evaluiert werden, wie hoch die Genexpression der gewählten endogenen Kontrolle in den verwendeten Zellen ist. Die erste Möglichkeit besteht darin, die zu untersuchende Probe aufzuteilen und die endogene Kontrolle und die Zielsequenz in zwei getrennten Reaktionsgefäßen auszuwerten. Die zweite Möglichkeit ist [das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex-Reaktion.]

Die Quantitative PCR kann für verschiedene Anwendungen genutzt werden, wie z.B. das Monitoring der Genexpression oder die Bestimmung der Viruslast im Rahmen von

[Seite 57:]

Pathogenesestudien (BUSTIN 2000, FREEMAN et al. 1999, HALFORD 1999, HEID et al. 1996).

Das Prinzip der Quantifizierung der Ausgangsmenge an Nukleinsäure mittels real-time RTPCR unterscheidet sich grundlegend von der Quantifizierung mit Hilfe einer konventionellen RT-PCR, da hier nicht die absolute Menge an PCR-Produkt, das bis zum Ende der Reaktion entsteht, gemessen wird. Bei der QRT-PCR wird der CT-Wert genutzt. Der CT-Wert verhält sich umgekehrt proportional zum Logarithmus der Ausgangsmenge an Nukleinsäure (HIGUCHI et al. 1993). Rein theoretisch könnte anhand des CT-Wertes auf die ursprüngliche Matrizenmenge zurückgeschlossen werden, wenn gleichzeitig die Vermehrungsrate der PCR bekannt wäre. Die Amplifikation eines bestimmten Fragments wird aber von vielen Faktoren beeinflusst, so dass es nicht möglich ist, die genaue Vermehrungsrate einer Reaktion zu ermitteln (BUSTIN 2000). Es ist daher einfacher, parallel zu den zu untersuchenden Proben, Proben mit bekannter Menge in Form eines Standards zu amplifizieren und die so ermittelten CT-Werte miteinander zu vergleichen. Die Quantifizierung kann relativ oder absolut erfolgen. Sie unterscheidet sich in einem unterschiedlichen Prinzip des verwendeten Standards.

[...]

Grundsätzlich gibt es zwei Arten der Berechnung der relativen Menge: Die Standardkurven- Methode und die ΔΔCt-Methode (LIVAK u. SCHUTTEN 2001).

Beide Berechnungsmethoden benötigen neben der eigentlichen Zielsequenz auch eine „endogene Kontrolle“ (Referenzgen), die mit amplifiziert wird. Diese endogene Kontrolle wird als Housekeeping Gene bezeichnet. Es ist eine aktive Referenz –eine Normalisierungwomit die Menge an Ziel-RNA im Verhältnis zu der insgesamt in der Probe vorhandenen RNA gesetzt wird. Als endogene Kontrolle sollten Gene verwendet werden, die ubiquitär und in einer konstanten Menge in den verwendeten Zellen vorkommen wie z.B. 18s rRNA, GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase) oder β-Aktin. Sie sollten unter den verschieden experimentellen Bedingungen immer konstant exprimiert werden. Da 18s rRNA keinen Poly-A-Schwanz besitzt, kann sie nicht als endogene Kontrolle für eine RT-PCR eingesetzt werden, bei der Oligo-dTs für den Schritt der Reversen Transkription verwendet werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass es zu einer unterschiedlichen Expression von Housekeeping Genen in Zellen kommen kann (BUSTIN 2000). Die Verwendung z.B. von

[Seite 58:]

GAPDH ist daher kritisch zu sehen. β-Aktin stellt womöglich eine bessere Alternative dar. Vorab sollte immer evaluiert werden, wie hoch die Genexpression der gewählten endogenen Kontrolle in den verwendeten Zellen ist. Die erste Möglichkeit besteht darin, die zu untersuchende Probe aufzuteilen und die endogene Kontrolle und die Zielsequenz in zwei getrennten Reaktionsgefäßen auszuwerten. Die zweite Möglichkeit ist, das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex- Reaktion.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[15.] Ad/Fragment 071 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 15:35:52 Singulus
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 71, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 58, 60, Zeilen: 58: 5 ff.; 60: 14-19
[Die zweite Möglichkeit ist,] das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex-Reaktion. Die Verwendung von Sonden, die mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert sind, erlaubt es prinzipiell, mehrere Fragmente in dem gleichen Reaktionsgefäß zu messen. Die Normalisierung der gemessenen Daten durch das Verhältnis zur endogenen Kontrolle verhindert Fehler, die auf gering veränderten PCR-Effektivitäten oder verschiedenen Ausgangskonzentrationen basieren.

1. Die Berechnung über eine Standardkurven-Methode:

Neben den zu untersuchenden Proben werden in der real-time PCR serielle Verdünnungen eines Housekeeping Gens und eines der Zielsequenz ähnlichen Standards zur Bestimmung der PCR-Effizienz mit analysiert. Genaue Konzentrationen müssen nicht bekannt sein. Ist die Effizienz der PCR-Reaktion von Standard und Housekeeping Gen gleich, so ist es ausreichend, für die weiteren Berechnungen nur die Standardkurve des Housekeeping Gens heranzuziehen. Im zweiten Schritt werden die CT-Werte für die zu untersuchenden Proben gegen die ermittelten Housekeeping Gen-CT-Werte „normalisiert“. Im letzten Schritt wird der resultierende niedrigere Wert als Kalibrator festgesetzt und gleich 1 gesetzt. So ergibt sich eine Relation beider Proben zu einander.

2. Alternativ können die CT-Werte miteinander verglichen werden; eine Standardkurve ist nicht nötig. Dies wird als ΔΔCt-Methode bezeichnet (LIVAK & SCHMITTGEN 2001). Grundlage hierfür ist eine gleiche Effizienz der Housekeeping Gen-PCR und der Zielsequenz- PCR. Die Formel für die Berechnung lautet:

2-ΔΔCt

ΔΔCT = ΔCtq – ΔCtcb

ΔCtq = CtX - CtR ; Normalisierter CT für die Probe

ΔCtb = CtX - CtR ; Normalisierter CT für den Kalibrator

CtX = CT der Zielsequenz der entsprechenden Probe

CtR = CT der Referenz der entsprechenden Probe

2.16.5 Vergleich real-time RT-PCR und konventionelle RT-PCR

Die quantitative real-time PCR beinhaltet zunächst alle Vorteile einer konventionellen PCR, nämlich die Schnelligkeit der Durchführung, die Sensitivität und die Nutzbarkeit einer Reihe von Ausgangsmaterialien. Durch das Entfallen der Agarose-Gel-Auswertung nach der PCR sowie das verkürzte Thermoprofil (Zwei-Schritt- anstatt Drei-Schritt-Programme), werden der [Zeit- und Arbeitsaufwand sowie das Kontaminationsrisiko für die Proben und für das Labor reduziert.]

Die zweite Möglichkeit ist, das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex-Reaktion. Die Verwendung von Sonden, die mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert sind, erlaubt es prinzipiell, mehrere Fragmente in dem gleichen Reaktionsgefäß zu messen.

Die Normalisierung der gemessenen Daten durch das Verhältnis zur endogenen Kontrolle verhindert Fehler, die auf gering veränderten PCR-Effektivitäten oder verschiedenen Ausgangskonzentrationen basieren.

1. Die Berechnung über eine Standardkurven-Methode:

Neben den zu untersuchenden Proben werden in der real-time PCR serielle Verdünnungen eines Housekeeping Gens und eines der Zielsequenz ähnlichen Standards zur Bestimmung der PCR-Effizienz mit analysiert. Genaue Konzentrationen müssen nicht bekannt sein. Ist die Effizienz der PCR-Reaktion von Standard und Housekeeping Gen gleich, so ist es ausreichend, für die weiteren Berechnungen nur die Standardkurve des Housekeeping Gens heranzuziehen. Im zweiten Schritt werden die CT-Werte für die zu untersuchenden Proben 1 und 2 gegen die ermittelten Housekeeping Gen-CT-Werte „normalisiert“. Im letzten Schritt wird der resultierende niedrigere Wert als Kalibrator festgesetzt und gleich 1 gesetzt. So ergibt sich eine Relation beider Proben zu einander.

2. Alternativ können die CT-Werte miteinander verglichen werden; eine Standardkurve ist nicht nötig. Dies wird als ΔΔCt-Methode bezeichnet (LIVAK u. SCHUTTEN 2001). Grundlage hierfür ist eine gleiche Effizienz der Housekeeping Gen-PCR und der Zielsequenz- PCR. Die Formel für die Berechnung lautet:

ΔΔCT = ΔCtq – ΔCtcb

ΔCtq = CtX - CtR ; Normalisierter CT für die Probe

ΔCtq = CtX - CtR ; Normalisierter CT für den Kalibrator

CtX = CT der Zielsequenz der entsprechenden Probe

CtR = CT der Referenz der entsprechenden Probe

[Seite 60]

Die quantitative real-time PCR beinhaltet zunächst alle Vorteile einer konventionellen PCR, nämlich die Schnelligkeit der Durchführung, die Sensitivität und die Nutzbarkeit einer Reihe von Ausgangsmaterialien. Durch das Entfallen der Agarose-Gel-Auswertung nach der PCR sowie das verkürzte Thermoprofil (Zwei-Schritt- anstatt Drei-Schritt-Programme), werden der Zeit- und Arbeitsaufwand sowie das Kontaminationsrisiko für die Proben und für das Labor reduziert.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Schumann

[16.] Ad/Fragment 072 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-09 12:42:47 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 72, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 60, 61, Zeilen: 60: 16ff; 61: 1 ff.
[Durch das Entfallen der Agarose-Gel-Auswertung nach der PCR sowie das verkürzte Thermoprofil (Zwei-Schritt- anstatt Drei-Schritt-Programme), werden der] Zeit- und Arbeitsaufwand sowie das Kontaminationsrisiko für die Proben und für das Labor reduziert. Die Agarose-Gelelektrophorese braucht nicht automatisiert werden, denn sie ist bei den real-time PCRs nicht notwendig.

Viele der zurzeit erhältlichen real-time PCR-Systeme bieten zudem einen hohen Probendurchsatz. So können in den meisten Geräten 96 Proben, in einigen auch 384 Proben auf einmal analysiert werden. Dies bedeutet wiederum eine Zeitersparnis gegenüber der Standard PCR.

Die Sensitivität der QRT-PCR ist laut BUSTIN und MACKAY 100 bis 1000-fach höher als in der konventionellen PCR. So liegt die Nachweisgrenze eines Amplifikates im Agarose-Gel bei 2 bis 4 ng, während in der real-time PCR Nachweisgrenzen von 2 bis 20 pg postuliert werden (BUSTIN 2000; MACKAY et al. 2002 ).

Die Real-time PCR ermöglicht eine exaktere Quantifizierung des Ausgangsproduktes als die konventionelle PCR, da im Gegensatz zur Standard PCR im exponentiellen Bereich der Reaktion gemessen wird. Dies ermöglicht zudem eine Quantifizierung in einem weiteren Bereich als bei der konventionellen PCR.

Als nachteilig gestaltet sich die Inkompatibilität einiger real-time PCR Geräte für die Verwendung bestimmter Sondensysteme, sowie die noch stark eingeschränkte Multiplexfähigkeit der meisten Geräte (MACKAY 2002).

Ein weiterer Nachteil sind die Programme, die für die Auswertung der real-time PCR verwendet werden. So wird auf den derzeit erhältlichen Geräten unterschiedlichste Software mit unterschiedlichen Betriebssystemen genutzt. Dies erschwert die Vergleichbarkeit der ermittelten Ergebnisse, im Speziellen der gemessenen Fluoreszenzdaten und der CT-Werte. Die zur Kalkulation der Werte verwendeten Algorithmen sind einheitlich und standardisiert, doch werden die ermittelten Daten unterschiedlich präsentiert und aufgearbeitet. In diesem Zusammenhang gestaltet sich auch die klare Definition des Schwellenwertes (Threshold) schwierig. Derzeit ist nur definiert, dass die zur Berechnung des Schwellenwertes genutzte Fluoreszenz zwischen Zyklus 3-15 gemessen werden muss. Die derzeitige Definition lässt durchaus Spielraum für Modifikationen.

Durch das Entfallen der Agarose-Gel-Auswertung nach der PCR sowie das verkürzte Thermoprofil (Zwei-Schritt- anstatt Drei-Schritt-Programme), werden der Zeit- und Arbeitsaufwand sowie das Kontaminationsrisiko für die Proben und für das Labor reduziert. Die Agarose-Gelelektrophorese kann nicht automatisiert werden, denn sie ist bei den real-time PCRs nicht notwendig.

Viele der zurzeit erhältlichen real-time PCR-Systeme bieten zudem einen hohen Probendurchsatz. So können in den meisten Geräten 96 Proben, in einigen auch 384 Proben auf einmal analysiert werden. Dies bedeutet wiederum eine Zeitersparnis gegenüber der Standard PCR.

[...]

Die Sensitivität der QRT-PCR ist laut BUSTIN und MACKAY 100 bis 1000-fach höher als in der konventionellen PCR. So liegt die Nachweisgrenze eines Amplifikates im Agarose-Gel bei 2 bis 4 ng, während in der real-time PCR Nachweisgrenzen von 2 bis 20 pg postuliert werden (BUSTIN 2000; MACKAY 2002).

Die Real-time PCR ermöglicht eine exaktere Quantifizierung des Ausgangsproduktes als die konventionelle PCR, da im Gegensatz zur Standard PCR im exponentiellen Bereich der Reaktion gemessen wird. Dies ermöglicht zudem eine Quantifizierung in einem weiteren Bereich als bei der konventionellen PCR.

[Seite 61:]

Als nachteilig gestaltet sich die Inkompatibilität einiger real-time PCR Geräte für die Verwendung bestimmter Sondensysteme, sowie die noch stark eingeschränkte Multiplexfähigkeit der meisten Geräte (MACKAY 2002).

[...]

Ein weiterer Nachteil sind die Programme, die für die Auswertung der real-time PCR verwendet werden. So wird auf den derzeit erhältlichen Geräten unterschiedlichste Software mit unterschiedlichen Betriebssystemen genutzt. Dies erschwert die Vergleichbarkeit der ermittelten Ergebnisse, im Speziellen der gemessenen Fluoreszenzdaten und der CT-Werte. Die zur Kalkulation der Werte verwendeten Algorithmen sind einheitlich und standardisiert, doch werden die ermittelten Daten unterschiedlich präsentiert und aufgearbeitet. In diesem Zusammenhang gestaltet sich auch die klare Definition des Schwellenwertes (Threshold) schwierig. Derzeit ist nur definiert, dass die zur Berechnung des Schwellenwertes genutzte Fluoreszenz zwischen Zyklus 3-15 gemessen werden muss. Die derzeitige Definition lässt durchaus Spielraum für Modifikationen.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[17.] Ad/Fragment 100 08 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-09 23:27:53 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 100, Zeilen: 8-20
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 80 f., Zeilen: 80. 24 ff.; 81 1 ff.
3.3.5 SYBR Green TM real-time PCR

Für die Etablierung eines Sybr Green™ PCR-Protokolls wurde das Brilliant™ SYBR Green QPCR Master Mix™ Kit (s.3.2.2) verwendet.

Die Synthese der cDNA erfolgte nach gleichem Protokoll (s.3.3.4.6) wie für konventionelle PCR. Für die SYBR Green™ PCR wurden 4 μl der synthetisierten cDNA mit 25 μl des zweifach konzentrierten Mastermixes, sowie 1 μl eines Primers (10 pmol), 0,75 μl des vorher 1 zu 500 verdünnten Referenzfarbstoffes ROX (Endkonzentration 30 nM) und 18,25 μl sterilen Wassers (s.3.2.2) vorsichtig in einem 0,5 ml QRT-PCR Reaktionsgefäß (s.3.2.1) gemischt. Der Mastermix beinhaltete dabei folgendes: MgCl2, dNTPs, Tris-HCl, KCl, SureStart™ Taq-Polymerase. Angaben zur Konzentration dieser Ionen wurden vom Hersteller nicht gemacht. Nach der Mischung aller Reaktionskomponenten wurde das Reaktionsgefäß in das real-time PCR Gerät (Mx 4000, STRATAGENE; s.3.1) überführt und folgendes Programm gestartet:

Ad 100a diss.png

3.2.7 SYBR Green™ real-time PCR

Für die Etablierung eines Sybr Green™ PCR-Protokolls wurde das Brilliant™ SYBR Green QPCR Master Mix™ Kit (9.2.1) verwendet.

Die Synthese der cDNA erfolgte nach einem laboreigenen optimierten Protokoll (siehe Protokoll 6) in einem 40 μl Reaktionsansatz in 0,5 ml-Reaktionsgefäßen. Für die SYBR Green™ PCR wurden 6 μl für Protokoll 2 und 4 μl für Protokoll 6 der synthetisierten cDNA mit 25 μl des zweifach konzentrierten Mastermixes, sowie 1 μl eines Primers ([10 pmol] - Protokoll 2; [50 pmol] - Protokoll 6), 0,75 μl des vorher 1 zu 500 verdünnten Referenzfarbstoffes ROX (Endkonzentration 30 nM) und 16,25 μl bzw. 18,25 μl sterilen Wassers (9.3.6) vorsichtig in einem 0,5 μl QRT-PCR Reaktionsgefäß (9.6.2) gemischt. Der Mastermix beinhaltete dabei folgende Ionen: MgCl2, dNTPs, Tris-HCl, KCl, SureStart™ Taq-Polymerase. Angaben zur Konzentration dieser Ionen wurden vom Hersteller nicht gemacht (9.2.1).

[Seite 81:]

Nach der Mischung aller Reaktionskomponenten wurde das Reaktionsgefäß in das real-time PCR Gerät (Mx 4000, STRATAGENE; 9.7) überführt und folgendes Programm gestartet:

Ad 100a source.png

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[18.] Ad/Fragment 101 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-09 23:30:23 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 101, Zeilen: 1-10
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 81, 85, 86, Zeilen: 81: 3-7; 85: unten; 86: 1 ff.
Während des Programms erfolgte die Auswertung anhand einer Schmelzpunktanalyse. Dazu

wurde das PCR-Produkt von 50 °C auf 95 °C erhitzt und kontinuierlich die Fluoreszenz in 1 °C Schritten (30 sec. je 1 °C) gemessen.

3.3.5.1 Auswertung und Quantifizierung der SYBR Green tm real-time PCR

Die Anregung des SYBR Greens™ erfolgte bei 497 nm, die Anregung des Referenzfarbstoffs ROX bei 584 nm. Die emittierte Fluoreszenz des SYBR Greens™ wurde während des Annealingschritts bei 520 nm gemessen. Die emittierte Fluoreszenz des Referenzfarbstoffs ROX wurde ebenso während des Annealingschritts bei 612 nm gemessen. Die Auswertung des Laufs wurde mittels eines Dell Computers (Microsoft Windows 98 als Betriebssystem) mit der Software Mx4000 v3.00 Build 95, Schema 38 der Fa. STRATAGENE durchgeführt.

Während des Programms erfolgte die Auswertung (siehe 3.2.9.1). An dieses Programm

anschließend erfolgte eine Schmelzpunktanalyse. Dazu wurde das PCR-Produkt von 50 °C auf 95 °C erhitzt und kontinuierlich die Fluoreszenz in 1 °C Schritten (Dauer je 1 °C jeweils 30 sec) gemessen.

[Seite 85:]

3.2.9.1 Auswertung der SYBR Green™ real-time PCR

Die Anregung des SYBR Greens™ erfolgte bei 497 nm, die Anregung des Referenzfarbstoffs ROX bei 584 nm. Die emittierte Fluoreszenz des SYBR Greens™ wurde während des Annealingschritts bei 520 nm gemessen. Die emittierte Fluoreszenz des Referenzfarbstoffs

[Seite 86:]

ROX wurde ebenso während des Annealingschritts bei 612 nm gemessen. Die Auswertung des Laufs wurde mittels eines Dell Computers (Microsoft Windows 98 als Betriebssystem) mit der Software Mx4000 v3.00 Build 95, Schema 38 der Fa. STRATAGENE durchgeführt.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[19.] Ad/Fragment 169 25 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-07 10:30:44 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 169, Zeilen: 25-31
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 60, Zeilen: 14 ff., 27 ff.
Die quantitative real-time PCR beinhaltet zunächst alle Vorteile einer konventionellen PCR, nämlich die Schnelligkeit der Durchführung, die Sensitivität und die Nutzbarkeit einer Reihe von Ausgangsmaterialien.

Die Sensitivität der QRT-PCR ist laut BUSTIN und MACKAY 100 bis 1000-fach höher als in der konventionellen PCR. So liegt die Nachweisgrenze eines Amplifikates bei der konventionellen PCR (Agarose-Gel) bei 2 bis 4 ng, während in der real-time PCR (rt-PCR) Nachweisgrenzen von 2 bis 20 pg postuliert werden (BUSTIN 2000; MACKAY et al. 2002).

Die quantitative real-time PCR beinhaltet zunächst alle Vorteile einer konventionellen PCR, nämlich die Schnelligkeit der Durchführung, die Sensitivität und die Nutzbarkeit einer Reihe von Ausgangsmaterialien. [...]

[...]

Die Sensitivität der QRT-PCR ist laut BUSTIN und MACKAY 100 bis 1000-fach höher als in der konventionellen PCR. So liegt die Nachweisgrenze eines Amplifikates im Agarose-Gel bei 2 bis 4 ng, während in der real-time PCR Nachweisgrenzen von 2 bis 20 pg postuliert werden (BUSTIN 2000; MACKAY 2002).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[20.] Ad/Fragment 170 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-07 10:39:42 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 170, Zeilen: 1-4
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 60, Zeilen: letzter Absatz
Die Real-time PCR ermöglicht eine exaktere Quantifizierung des Ausgangsproduktes als die konventionelle PCR, da im Gegensatz zur konventionellen PCR im exponentiellen Bereich der Amplifikationsreaktion gemessen wird. Dies ermöglicht zudem eine Quantifizierung in einem weiteren Bereich als bei der konventionellen PCR (Endpunktmethode, Vergleich der Bandenstärke). Die Real-time PCR ermöglicht eine exaktere Quantifizierung des Ausgangsproduktes als die konventionelle PCR, da im Gegensatz zur Standard PCR im exponentiellen Bereich der Reaktion gemessen wird. Dies ermöglicht zudem eine Quantifizierung in einem weiteren Bereich als bei der konventionellen PCR.
Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Fortsetzung von der Vorseite.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

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