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Quelle:Ad/Frank 2000

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Angaben zur Quelle [Bearbeiten]

Autor     Frank, Jörg Heinrich Marstrand
Titel    Wanderungsverhalten neutrophiler Granulozyten in einem Transmigrationsverfahren
Ort    Hannover
Jahr    2000
Anmerkung    Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctor Medicinae Veterinariae durch die Tierärztliche Hochschule Hannover. Aus der Klinik für Geburtshilfe und Gynäkologie des Rindes (im Richard-Götze-Haus) und der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2000
URL    http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/frankj_2000.pdf

Literaturverz.   

ja
Fußnoten    ja
Fragmente    9


Fragmente der Quelle:
[1.] Ad/Fragment 078 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-11 07:13:19 Singulus
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 78, Zeilen: 1-5
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 42, Zeilen: 4-9
Interleukin-8 übt als Chemokin eine primär chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten aus. Zum Einsatz kam rekombinantes humanes, lyophilisiertes Interleukin-8 (rhIL-8, 8,4 kDa, 72 Aminosäuren, s. 3.2.2), das in PBS (3.2.2) mit 0,1% BSA (3.2.2) auf 1 μg/ml verdünnt und in aliquoten Teilen zu 1 ml bei –20°C eingefroren wurde. Vor Gebrauch wurde diese Lösung auf die benötigte Endkonzentration (0,1 μg/ml) mit PBS eingestellt. Interleukin-8 (s. 3.1.2) übt als Chemokin eine primär chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten aus, wobei ihm noch weitere Funktionen zugeschrieben werden (s. 2.5.2). Zum Einsatz kam rekombinantes humanes, lyophilisiertes Interleukin-8 (rhIL-8, 8,0 kDa, 72 Aminosäuren), das in PBS mit 0,1% BSA (s. 3.1.2) auf 1 μg/ml verdünnt und in

aliquoten Teilen zu 100 μl oder 200 μl bei –20°C eingefroren wurde. Vor Gebrauch wurde diese Lösung auf die benötigte Endkonzentration (10-100 ng/ml) in R0+ eingestellt.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[2.] Ad/Fragment 079 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-11 07:10:18 Singulus
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 79, Zeilen: 1-8
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 45, Zeilen: 13-20
Das Fluorochrom Propidiumjodid (PJ, s. 3.2.2) gelangt nur bei Membrandefekten ins Innere der Zelle und interkaliert dort mit der doppelsträngigen DNA, so dass es nicht mehr aus der Zelle austreten kann. Folglich diente Propidiumjodid als Hilfsmittel zur Beurteilung der morphologischen Integrität der untersuchten Zellen und damit ihrer Vitalität. Aus der

kristallinen Trockensubstanz wurde mit Hilfe von PBS (3.2.2) die Gebrauchslösung (100 μg/ml) hergestellt, die in aliquoten Teilen zu 1 ml bei –20°C eingefroren wurde. Bei durchflusszytometrischen Messungen wurden jeder 20 μl PJ-Gebrauchslösung pro ml Untersuchungssuspension zugesetzt, was einer Endkonzentration von 2 μg PJ/ml entsprach.

Das Fluorochrom Propidiumjodid (Pj, s. 3.1.2) gelangt nur bei Membrandefekten ins Innere der Zelle und interkaliert dort mit der doppelsträngigen DNA. Somit dient Propidiumjodid als Hilfsmittel zur Beurteilung der morphologischen Integrität der untersuchten Zellen und damit ihrer Vitalität. Aus der kristallinen Trockensubstanz wurde mit Hilfe von PBS die Gebrauchslösung (100 μg/ml) hergestellt, die in aliquoten Teilen zu 1 ml bei –20°C eingefroren wurde. Bei durchflußzytometrischen Messungen enthielt jede Probe eine Konzentration von 20 μl Pj-Gebrauchslösung pro ml Untersuchungssuspension, was einer Endkonzentration von 2 μg Pj/ml entspricht.
Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[3.] Ad/Fragment 079 15 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-11 07:11:37 Singulus
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 79, Zeilen: 15-27
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 45, Zeilen: 21-33
Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung

Verwendung fanden bovine, mononukleäre Zellen (MNC), die gemäß der unter 0 zur Gewinnung mononukleärer Zellen beschriebenen Methode mit einer Reinheit von über 98% gewonnen wurden. Nach dem dritten Waschgang wurde die Zellsuspension mit dem monoklonalen Antikörper (mAk) Bo1 (500 μl unverdünnte Lösung) versetzt und für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Es folgten drei weitere Waschgänge (jeweils 300 x g, 8 Minuten, 4°C) mit MIF-Puffer (s. 3.2.4) und eine weitere Inkubation bei 4°C für 30 Minuten mit dem konjugierten Antikörper (DTAF - ZgαM – IgG + M (H + L), 500 μl, 1:100 verdünnt, s. 3.2.2). Nach weiteren drei Waschgängen (s. oben) wurden die Zellen mit Paraformaldehyd (4% in PBS, s. 3.2.4) 12–24 Stunden lichtgeschützt bei 4°C fixiert. Nach der Fixation wurden die Zellen dreimal mit MIF-Puffer gewaschen (s. oben) und dann in einer Endkonzentration von 3 bis 6 x 104 Zellen/50 μl Sheath fluid-Propidiumjodid-Lösung (2 μg PJ/ml Sheath fluid(3.2.5), bei 4°C lichtgeschützt gelagert.

Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung

Verwendung fanden bovine, mononukleäre Zellen, die mit Hilfe eines Ficoll®-Dichtegradienten mit einer Reinheit von über 98% aus EDTA-Blut gewonnen wurden. Nach hypotoner Lyse und zwei Waschgängen mit PBS (jeweils 300 x g, 8 min, 4°C) wurde die Zellsuspension mit dem mAk Bo1 (500 μl unverdünnte Lösung, s. 3.1.5) versetzt und für 30 min bei 4°C inkubiert. Es folgten drei weitere Waschgänge (jeweils 300 x g, 8 min, 4°C) mit MIF-Puffer (s. 3.1.3.1) und eine weitere Inkubation bei 4°C für 30 min mit dem konjugierten Antikörper (DTAF - Zg? M – IgG + M (H + L), 500 μl, 1:100 verdünnt, s. 3.1.5). Nach weiteren drei Waschgängen (s. oben) wurden die Zellen mit 4%igem Paraformaldehyd (gelöst in PBS, s. 3.1.2) 12–24 Stunden lichtgeschützt bei 4°C fixiert. Nach der Fixation wurden die Zellen dreimal mit MIF-Puffer gewaschen (s. oben) und dann in einer Endkonzentration von 4–6 x 104 Zellen/50μl Sheath fluid-Propidiumjodid-Lösung (2 ng Pj/ml Sheath fluid, siehe unten) bei 4°C lichtgeschützt gelagert.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[4.] Ad/Fragment 080 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-11 07:03:36 Singulus
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 80, Zeilen: 1-21
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 41, Zeilen: 15-35
Die Erfassung der Fähigkeit von Leukozyten zu phagozytieren, erfordert für die durchflusszytometrische Messung eine Fluoreszenzmarkierung der Ingestionspartikel. Hierzu wurden 1,5 ml mikrobieller Partikel Suspension (MIM) mit 3,5 ml FITC-Puffer (FITC-Endkonzentration 0,00066%) und 50 μl 10%igem Natriumazid (Endkonzentration 0,05%,) in lichtgeschützten Eppendorf-Reaktionsgefäßen (s.3.2.1) für 20 Stunden bei Raumtemperatur im Überkopfschüttler durchmischt. Danach wurde diese Suspension dreimal mit PBS (3.2.4) bei 14.000 x g für 1 Minute gewaschen und dann auf ca 2 x 108 Mikroben/ml PBS (Zellzählkammer nach Bürker (3.1), Fluoreszenzmikroskop (3.1) eingestellt. In aliquoten Teilen zu 1 ml wurde diese Suspension bei –20°C gelagert.

Serum zur Opsonisierung der Mikroben

Zur Opsonisierung der mikrobiellen Partikel wurde natives gepooltes Pferdeserum verwendet, das von 3 gesunden Pferden unter keimarmen Bedingungen (Vacutainer ohne Gerinnungshemmer, 3.2.1) gewonnen wurde. Das Blut wurde bei Raumtemperatur stehengelassen, bis eine deutliche Koagulation sichtbar war. Die Verbindung zwischen der Röhrchenwand und dem Koagulat wurde mit Hilfe einer sterilen Pasteurpipette gelöst. Dann wurden die Röhrchen für 15 Min mit 2000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Um noch verbliebene korpuskuläre Bestandteile zu entfernen, wurde der Überstand gewonnen und bei 3.500 x g für 10 Min zentrifugiert. Danach wurde das Serum der drei Tiere zu gleichen Anteilen zusammengegeben (gepoolt). Die Lagerung erfolgte in aliquoten Teilen zu 100 μl, 200 μl und 1 ml bei –80°C. Zum Einsatz kam eine 1:10 mit PBS (3.2.4) verdünnte Gebrauchslösung.

Die Erfassung der Phagozytosefähigkeit von PMN erfordert für die durchflußzytometrische Messung eine Fluoreszenzmarkierung der Ingestionspartikel. Hierzu wurden 3 ml einer standardisierten Streptokokken-Lösung (Omnisorb®, s. 3.1.2) mit 7 ml FITC-Puffer (s. 3.1.3.1, FITC-Endkonzentration 0,015%) und 50 μl 10%igem Natriumazid (Endkonzentration 0,05%, s. 3.1.2) in lichtgeschützten Eppendorf-Reaktionsgefäßen (s. 3.1.1) für 20 Stunden bei Raumtemperatur im Überkopfrüttler durchmischt. Danach wurde diese Suspension dreimal mit PBS bei 14.000 x g für 1 min gewaschen und dann auf 2 x 108 Bakterien/ml PBS (Zellzählkammer nach Bürkner, Fluoreszenzmikroskop s.3.1.1) eingestellt. In aliquoten Teilen zu 1 ml wurde diese Suspension bei –20°C gelagert.

Serum zur Opsonisierung der Streptokokken

Zur Opsonisierung der Bakterien wurde natives Serum verwendet, das aus dem Blut von drei Kühen der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover unter keimarmen Bedingungen (Vacutainer ohne Gerinnungshemmer, s. 3.1.1) gewonnen wurde. Das Blut wurde bei Raumtemperatur stehengelassen, bis eine deutliche Koagulation sichtbar war. Die Verbindung zwischen der Röhrchenwand und dem Koagulat wurde mit Hilfe einer Pasteurpipette gelöst. Dann wurden die Röhrchen 15 min mit 2.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Um noch verbliebene korpuskuläre Bestandteile zu entfernen, wurde der Überstand gewonnen und bei 3.500 x g für 10 min zentrifugiert. Danach wurde das Serum der drei Tiere zu gleichen Anteilen zusammengegeben (gepoolt). Die Lagerung erfolgte in aliquoten Teilen zu 100μl, 200μl und 1ml bei –80°C. Zum Einsatz kam eine 1:10 mit PBS verdünnte Gebrauchslösung.

Anmerkungen

Im wesentlichen werden hier nur aus "Kühen" "Pferde" und aus "Bakterien" "mikrobielle Partikel".

Kein Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), (Hindemith), (SleepyHollow02)

[5.] Ad/Fragment 085 12 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-11 07:06:06 Singulus
Ad, BauernOpfer, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
BauernOpfer
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 85, Zeilen: 10-31
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 56-57, Zeilen: 56: 7-15 - 57: 1-12
Für die Gewinnung von PMN in sehr hoher Reinheit folgte der 30-minütigen Erythrozyten-Sedimentation und anschließender hypotoner Erythrolyse (s.3.3.2.1) eine selektive Transmigration equiner PMN auf rhIL-8 nach FRANK (2000). In vivo führen chemotaktische Stimuli zum Anhaften der zirkulierenden PMN an Gefäßendothelzellen und zur Diapedese. Diese Durchwanderung der Kapillarwand soll hier durch eine künstliche Barriere in Form einer Polycarbonatmembran mit 3 μm großen Poren (s.3.2.1) simuliert werden.

Reinigung der Transmigrationskammer (s.3.1)

Vor der Testdurchführung wurden die Acrylanteile der Kammer in einmolarer Natriumhydroxid-Lösung (s.3.2.2) und die Silikondichtungsmatte (s.3.1) in Aqua tridest. gelegt (60°C, 30 min). Danach wurden sie dreimal mit Aqua tridest. gespült und dann für 30 min zum Trocknen in einen Brutschrank (37°C) gestellt.

Nach der Testdurchführung wurden die Kammerteile zweimal mit Aqua tridest. gespült und in Aqua tridest. gelegt (30 min, Raumtemperatur). Danach wurden sie mit Papiertüchern abgetrocknet und trocken gelagert. Aufgrund von möglichen Veränderungen in Struktur und Oberfläche der Transmigrationskammer empfiehlt der Hersteller keine Autoklavierung derselben durchzuführen. Auch viele Reinigungs- und Desinfektionsmittel sollten nicht verwendet werden (s. Produktinformationen vom Hersteller).

Beschicken der Kammer

Als Orientierungspunkte dienten das aufgestanzte Zeichen „np“ auf den Acrylanteilen der Kammer und die abgeschnittene Ecke der Silikonmatte (s.3.1). Sie befanden sich immer übereinander in der rechten oberen Ecke der Kammer. In die Vertiefungen der Bodenplatte wurden 300μl SFM3 Medium (s.3.2.3) mit Zusatz von 100ng/ml rhIL-8 (s.3.2.4) blasenfrei [einpipettiert.]


FRANK J. (2000) :
Wanderungsverhalten neutrophiler Granulozyten in einem Transmigrationsverfahren
Tierärztliche Hochschule Hannover, Dissertation

[Seite 56]

In vivo führen chemotaktische Stimuli zum Anhaften der zirkulierenden PMN an Gefäßendothelzellen und zur Diapedese. Diese Durchwanderung der Kapillarwand soll hier durch eine künstliche Barriere in Form einer Polycarbonatmembran mit 3 μm großen Poren simuliert werden.

Reinigung der Transmigrationskammer

Vor der Testdurchführung wurden die Acrylanteile der Kammer in einmolarer Natriumhydroxid-Lösung (s. 3.1.2 u. 3.1.8.5) und die Silikondichtungsmatte in Aqua tridest. gelegt (60°C, 30 min). Danach wurden sie dreimal mit Aqua tridest. gespült und dann für eine 30 min zum Trocknen in einen Brutschrank (37°C) gestellt.

[Seite 57]

Nach der Testdurchführung wurden die Kammerteile zweimal mit Aqua tridest. gespült und in Aqua tridest. gelegt (30 min, Raumtemperatur). Danach wurden sie mit Papiertüchern abgetrocknet und trocken gelagert. Aufgrund von möglichen Veränderungen in Struktur und Oberfläche der Transmigrationskammer empfiehlt der Hersteller keine Autoklavierung derselben durchzuführen. Auch viele Reinigungs- und Desinfektionsmittel sollten nicht verwendet werden (siehe Produktinformationen vom Hersteller).

Testdurchführung

Beschicken der Kammer: Als Orientierungspunkte dienten das aufgestanzte Zeichen „np“ auf den Acrylanteilen der Kammer und die abgeschnittene Ecke der Silikonmatte (s. 3.1.8.2). Sie befanden sich immer übereinander in der rechten oberen Ecke der Kammer. In die Vertiefungen der Bodenplatte wurden 300 μl der chemoattraktiven Substanz blasenfrei pipettiert.

Anmerkungen

Wortwörtliche Übernahme ohne jede Kennzeichnung.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[6.] Ad/Fragment 086 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-11 07:08:14 Singulus
Ad, BauernOpfer, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
BauernOpfer
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 86, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 57-58, Zeilen: 57: 12 ff. - 58: 5-10
Diese Flüssigkeit wurde mit 115 μl unverdünntem Percoll® (s.3.2.4) unterschichtet, das als eine Art „Auffangkissen“ und somit zur Verminderung der Adhärenz der gewanderten Zellen diente. Das Gesamtvolumen von 415 μl führte zur Bildung eines geringgradig positiven Flüssigkeitsmeniskus, um Luftblasen beim Auflegen der Membran zu vermeiden. Bei der Polycarbonatmembran (s.3.2.1) muß beachtet werden, dass diese eine glänzende (PVP-beschichtete) und eine matte, unbeschichtete Seite besitzt. Nach Angaben des Vertreibers der Membranen (Cytogen, Ober-Mörlen) adhärieren Zellen stärker an PVP als an das unbeschichtete Polycarbonat. Damit die Zellen nicht nach der Migration an der Unterseite der Membran verstärkt adhärieren, zeigte die PVP-Seite in allen Versuchsansätzen nach oben. Die trockene Polycarbonatmembran wurde vorsichtig auf die Vertiefungen gelegt, wobei man die zwei Enden der Membran mit zwei anatomischen Pinzetten (s.3.1) faßte. Die Membran muß dabei U-förmig durchhängen, um sie mittig beginnend nach außen luftblasenfrei auslegen zu können. Anschließend wurde die Silikondichtung aufgelegt, der zweite Acrylanteil der Kammer aufgedrückt und unter leichtem Druck festgeschraubt. Zuletzt wurde die Zellsuspension (200 μl, meist 2 x 107 Zellen/ml SFM10 (s.3.2.3)) in die obere Vertiefung gegeben.

Inkubation

Zur Inkubation wurde die Transmigrationskammer in eine feuchte Kammer gestellt (s.3.1) und diese für den gewünschten Zeitraum, meist für 3 Stunden, bei 37°C und 5% CO2, in einem Brutschrank inkubiert.

Gewinnung der PMN

Die Zellsuspension in den oberen Wells (= nicht gewanderte Zellen) wurde durch gründliches Pipettieren resuspendiert, um adhärente Zellen von der Oberseite der Membran zu lösen und dann vollständig entnommen, ohne dabei die Membran zu beschädigen. Dabei setzt man die Pipettenspitze möglichst am Rand der Membran vorsichtig auf, damit ein Durchstoßen der Membran vermieden wird. Die entnommene Zellsuspension wurde verworfen und die Membran mit einem sterilen Wattetupfer vorsichtig getrocknet. Nach Entfernung der Schraubenmuttern wurde der obere Kammerteil möglichst waagerecht und zügig abgehoben. Hierbei löst sich die Silikonmatte und die Membran mit ab. Nach guter Durchmischung der Zellsuspension (=gewanderte Zellen) und des Percolls® wurde jede der Vertiefungen der unteren Platte geleert. Die Zellsuspension (435 μl, etwa 15 μl Flüssigkeitsverlust pro Well durch das Abheben der Membran) wurde dann in etwa 12 ml PBS (s.3.2.4) in ein 14 ml Röhrchen übertragen, gut durchpipettiert und einmal bei 100 x g und 4°C für 8 Min [zentrifugiert, um Percoll® und andere lösliche Komponenten zu entfernen.]

[Seite 57]

Diese Flüssigkeit wurde mit 115 μl unverdünntem Percoll® (s. 3.1.4) unterschichtet, das als eine Art „Auffangkissen“ und somit zur Verminderung der Adhärenz der gewanderten Zellen diente. Das Gesamtvolumen von 415 μl führte zur Bildung eines geringgradig positiven Flüssigkeitsmeniskus, um Luftblasen beim Auflegen der Membran zu vermeiden. Bei der Polycarbonatmembran (s. 3.1.1 u. 3.1.8.3) muß beachtet werden, daß diese eine glänzende (PVP-beschichtete) und eine matte, unbeschichtete Seite besitzt. Nach Angaben des Vertreibers der Membranen (Cytogen, Ober-Mörlen) adhärieren Zellen stärker an PVP als an das unbeschichtete Polycarbonat. Damit die Zellen nicht nach der Migration an der Unterseite der Membran verstärkt adhärieren, zeigt die PVP-Seite in allen Versuchsansätzen nach oben. Die trockene Polycarbonatmembran wurde vorsichtig auf die Vertiefungen gelegt, wobei man die zwei Enden der Membran mit zwei anatomischen Pinzetten (s. 3.1.1) faßte. Die Membran muß dabei U-förmig durchhängen, um sie mittig beginnend nach außen luftblasenfrei auslegen zu können. Anschließend wurde die Silikondichtung aufgelegt, der zweite Acrylanteil der Kammer aufgedrückt und unter leichtem Druck festgeschraubt. Falls nicht andere Versuchsvorgaben zu berücksichtigen waren, wurde zuletzt die Zellsuspension (200 μl, meist 2 x 107 Zellen/ml R0+ ) in die obere Vertiefung gegeben.

Inkubation: Zur Inkubation wurde die Transmigrationskammer in eine feuchte Kammer gestellt (s. 3.1.8.4) und diese für den gewünschten Zeitraum, normalerweise für 2 Stunden, bei 37°C und 5% CO2, in einem Brutschrank inkubiert.

Gewinnung der Zellfraktionen: Die Zellsuspension in den oberen Wells (= nicht gewanderte Zellen) wurde durch gründliches Pipettieren resuspendiert, um adhärente Zellen von der Oberseite der Membran zu lösen, und dann entnommen. Dabei setzt man die Pipettenspitze möglichst am Rand der Membran vorsichtig auf, damit ein Durchstoßen der Membran vermieden wird. Die entnommene Zellsuspension wurde in ein Probenröhrchen für die Auswertung im Durchflußzytometer gegeben.

Da sich an der Unterseite der Polycarbonatmembran noch Zellen befinden und diese in benachbarte Wells gelangen könnten, wurde nach Entfernung der Schraubenmuttern der obere Teil der Kammer möglichst waagerecht und zügig abgehoben. Hierbei löst sich die Silikonmatte und die Membran mit ab. Nach guter Durchmischung der Zellsuspension (= gewanderte Zellen) und des Percolls® wurde die Vertiefung der unteren Platte geleert.

[Seite 58]

[...] Der nicht für die Zellzahlbestimmung benötigte Teil der Zellsuspension (350 μl, etwa 15 μl Flüssigkeitsverlust pro Well durch das Abheben der Membran) wurde dann in etwa 12 ml PBS in ein 14 ml Röhrchen gegeben und einmal bei 100 x g und 4°C für 8 min zentrifugiert, um Percoll® und andere lösliche Komponenten zu entfernen.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme. Fortsetzung von Ad/Fragment_085_12. Der ursprüngliche Autor wird einmal auf der vorangegangenen Seite en passant erwähnt.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[7.] Ad/Fragment 087 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-11 07:09:00 Singulus
Ad, BauernOpfer, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
BauernOpfer
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 87, Zeilen: 1-2
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 58, Zeilen: 5-11
[Die Zellsuspension (435 μl, etwa 15 μl Flüssigkeitsverlust pro Well durch das Abheben der Membran) wurde dann in etwa 12 ml PBS (s.3.2.4) in ein 14 ml Röhrchen übertragen, gut durchpipettiert und einmal bei 100 x g und 4°C für 8 Min] zentrifugiert, um Percoll® und andere lösliche Komponenten zu entfernen. Der Überstand wurde verworfen und das Zellsediment resuspendiert. Der nicht für die Zellzahlbestimmung benötigte Teil der Zellsuspension (350 μl, etwa 15 μl Flüssigkeitsverlust pro Well durch das Abheben der Membran) wurde dann in etwa 12 ml PBS in ein 14 ml Röhrchen gegeben und einmal bei 100 x g und 4°C für 8 min zentrifugiert, um Percoll® und andere lösliche Komponenten zu entfernen. Der Überstand wurde verworfen und das Zellsediment resuspendiert.
Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme. Fortsetzung von Ad/Fragment_085_12 und Ad/Fragment 086 01. Der ursprüngliche Autor wird einmal auf Seite 85 en passant erwähnt.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[8.] Ad/Fragment 101 16 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-10 07:37:47 Singulus
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 101, Zeilen: 16-27
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 55, Zeilen: 1 ff.
3.3.6 Bestimmung der Phagozytosekapazität

Zur Bestimmung der Phagozytosekapazität kam ein von ZERBE (1994) etabliertes durchflusszytometrisches Verfahren in modifizierter Form zur Anwendung. Es ermöglicht Aussagen über den Anteil der phagozytierenden Leukozyten einer Zellsuspension und die mittlere Fluoreszenzintensität der Phagozytose-positiven Zellen als Maß für die Menge der phagozytierten Partikel als Ausdruck der Phagozytosestärke.

Testdurchführung

Als Phagozytosepartikel kamen die in (s.3.2.7) beschriebenen FITC-markierten Mikroben zum Einsatz. Die Mikrobensuspension (2 x 108 mikrobelle Partikel/ml PBS) in den Vorratsröhrchen wurden nach dem Auftauen resuspendiert und auf zwei 1,5 ml Reaktionsgefäße (Cups) verteilt. Diese wurden dann bei 14.800 x g für 60 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugiert.


ZERBE H (1994)
Funktionelle und phänotypische Untersuchungen polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten aus Blut und Uterus des Rindes.
Dissertation Tierärztliche Hochschule Hannover

3.2.8 Bestimmung der Phagozytosekapazität

Zur Bestimmung der Phagozytosekapazität kam eine von ZERBE (1994) etablierte, durchflußzytometrische Testmethode mit Modifikationen zur Anwendung. Sie ermöglicht Aussagen über den Anteil der phagozytierenden Granulozyten einer Zellsuspension und die mittlere Fluoreszenzintensität der phagozytose-positiven PMN als Maß für die Menge der phagozytierten Partikel.

Testdurchführung

Als Phagozytosepartikel kamen die in 3.1.7 beschriebenen FITC-markierten Streptokokken zum Einsatz. Die Vorratsröhrchen mit 1 ml Bakteriensuspension (2 x 108 Bakterien/ml PBS) wurden bei 15.000 x g für 60 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugiert.


ZERBE, H. (1994):
Funktionelle und phänotypische Untersuchung polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten aus Blut und Uterus des Rindes.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.

Anmerkungen

Adaptiert, vielfach mit weitgehend wörtlicher Übereinstimmung, dennoch ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[9.] Ad/Fragment 102 02 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-10 07:35:55 Singulus
Ad, Fragment, Frank 2000, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 102, Zeilen: 2-21
Quelle: Frank 2000
Seite(n): 55, Zeilen: 16-34
Diese Ansätze wurden anschließend für 45 Min im Brutschrank inkubiert (37°C, 5% CO2).

Nach Resuspension wurden die Wells einer 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatte (s. 3.2.1) mit je 50 μl dieser Mikrobensuspensionen beschickt. Diesen Ansätzen wurden je 150 μl einer Zellsuspension mit einer Dichte von 0,66 x 106 Leukozyten/ml PBS hinzugegeben. Somit lag ein Zellen zu mikrobiellen Partikel-Verhältnis von ca 1:100 vor. Die Probensuspensionen wurden 30 Sekunden auf dem Mikrotiterplattenrüttler durchmischt und dann für 30 Min in einer feuchten Kammer (s. 3.1) im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert (s. 3.1). Nach erneuter Durchmischung auf dem Plattenrüttler, um optimale Zell-Mikroben-Kontakte zu gewährleisten, wurde die 30minütige Inkubation fortgesetzt. Abschließend wurde die Platte für 10 Min auf Eis gestellt, um die Reaktion zu stoppen. Die Proben wurden dann in 100 μl Sheath fluid-PJ-Gemisch (s.3.2.5) in Röhrchen für die Durchflusszytometrie überführt.

Auswertung

Pro Ansatz wurden 10.000 Partikel durchflusszytometrisch gemessen. Unter ihnen befanden sich neben Leukozyten auch Mikrobenaggregate, die mit gemessen wurden. Diese Bakterienaggregate werden bei der Auswertung mit dem Programm WinMDI© (TROTTER 1999) aufgrund ihrer hohen Fluoreszenzintensität in FL1 (Abbildung 9) und ihrer FSC-SSC Werte (Abbildung 9) erkannt und von der Auswertung ausgeschlossen. Es wurden nur PJ-negative Leukozyten bewertet. Es wurde ermittelt, welcher Prozentsatz der Zellen phagozytierte.


Zur Opsonisierung wurden die Streptokokken für 15 min im Brutschrank (37°C, 5% CO2) inkubiert. Nach Resuspension wurden die Vertiefungen einer 96-Well-Rundboden-Mikrotiterplatte (s. 3.1.1) mit 100 μl dieser Bakteriensuspensionen beschickt. Diesen Ansätzen wurden 100 μl einer Zellsuspension mit einer Dichte von 2 x 106 Leukozyten/ml PBS hinzugegeben. Somit lag ein Zellen-Bakterien-Verhältnis von 1:100 vor. Die

Probensuspensionen wurden 30 Sekunden auf dem Mikrotiterplattenrüttler durchmischt und dann für 30 min in einer feuchten Kammer (s. 3.1.8.4) im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach erneuter Durchmischung auf dem Plattenrüttler, um optimale Zell-Bakterien-Kontakte zu gewährleisten, wurde die 30minütige Inkubation wiederholt. Daraufhin wurde die Platte in Eiswasser gestellt, um die Reaktion zu stoppen. Die Proben wurden in 100 μl Sheath fluid mit 6 μg Propidiumjodid/ml (s. 3.1.9) aufgenommen.

Auswertung

Pro Ansatz wurden 5.000 Partikel durchflußzytometrisch gemessen. Unter ihnen befanden sich neben Leukozyten Bakterienaggregate, die im „lifegate“ (s. 3.2.2) mitgemessen wurden. Diese Bakterienaggregate werden aber bei der Auswertung mit dem Programm WinMDI (TROTTER 1998) aufgrund ihrer hohen Fluoreszenzintensität in FL 3 (s. 3.2.2) genauso wie Pj-positive Zellen erkannt und von der Auswertung ausgeschlossen. Es wurden nur Pj-negative Granulozyten bewertet. Zum einen wurde ermittelt, welcher Prozentsatz der Granulozyten phagozytierte (Abb. 5, Population B).


TROTTLER, J. (1998):

„WinMDI“ Auswertungsprogramm für Durchflußzytometerdaten, Version 2.4 (Freeware)
FTP://ftp.flosum.salk.edu/pub/ct oder
http://www.flosun.salk.edu/software.html oder
http://facs.scripps.edu/

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Im Literaturverzeichnis von Ad findet sich weder ein Verweis auf Trotter (1998) noch auf Trottler (1998). Korrekt wäre übrigens "Joe Trotter".

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

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