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Angaben zur Quelle [Bearbeiten]

Autor     Holger Matthias Scheibner
Titel    Methoden zur Isolierung von Ribonukleinsäure (RNA) zum Virusgenomnachweis mittels Polymerasekettenreaktion nach Reverser Transkription (RT-PCR)
Ort    Hannover
Jahr    2000
Anmerkung    Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctor Medicinae Veterinariae durch die Tierärztliche Hochschule Hannover. Tag der mündlichen Prüfung : 30.05.2000
URL    http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/scheibnerh_2000.pdf

Literaturverz.   

nein
Fußnoten    nein
Fragmente    2


Fragmente der Quelle:
[1.] Ad/Fragment 091 05 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-10 07:34:21 Singulus
Ad, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Scheibner 2000, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 91, Zeilen: 5-26
Quelle: Scheibner 2000
Seite(n): 69-70, Zeilen: 69: 2-3, 24-25, 27-28, 70: 1-16
3.3.4.3 Präparation der RNA aus equinen Leukozyten mit dem Machery&Nagel Nucleo Spin RNA

KitDas [sic] beim Machery & Nagel Nucleo Spin RNA Kit eingesetzte Prinzip nutzte die Bindung von Nukleinsäuren an Glasfaseroberflächen, wie bei den Kits der Firma Qiagen (s.unten) besprochen. Das Machery&Nagel Nucleo Spin RNA II Kit enthielt zusätzlich DNase I und den dazugehörigen Reaktionspuffer. 400 μl Puffer RA1 (Kitbestandteil) und 4 μl ß Mercaptoäthanol wurden in einem 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und zur 4 x 103 Zellen wurden hinzugefügt [sic] und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gut gemischt. Anschließend wurden 250 μl 96 % Äthanol hinzugefügt und der Isolierungsansatz auf einem Schüttler gut durchmischt. Die Nucleo Spin Säule (Kitbestandteil) wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gestellt, mit 750 μl RNA-Isolierungsansatz beladen und für 1 Min bei 10.000 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen, die Nucleo Spin Säule in ein neues Auffanggefäß überführt und für 1 Min bei 8000 g zentrifugiert. 10 μl rekonstitutierter DNase I (Kitbestandteil) und 90 μl DNase-Reaktionspuffer (Kitbestandteil) wurden miteinander gemischt und davon 95 μl direkt auf die Nucleo Spin Säulchen-Membran pipettiert und 15 min bei 24 °C inkubiert. Anschließend wurden 500 μl Puffer RA2 (Kitbestandteil) auf die Nucleo-Spin Säule gegeben. Es folgte 1 min Zentrifugation bei 8.000 x g. Danach wurden Durchfluß und Auffanggefäß verworfen und die Nucleo Spin Säule in ein neues 2 ml Auffanggefäß umgesetzt. 600 μl Puffer RA3 (Kitbestandteil) wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 1 min bei 8.000 x g zentrifugiert. Der Durchfluß wurde entsorgt. 250 μl Puffer RA3 wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 2 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Danach wurde die Nucleo Spin Säule vorsichtig in ein neues 1,6 ml Reaktionsgefäß überführt und 50 μl RNase freies Wasser (s.3.2.8) dazugegeben. Die RNA wurde durch 1 min Zentrifugation bei 10.000 x g eluiert.

[Seite 69]

Das beim Machery&Nagel Nucleo Spin RNA Kit eingesetzte Prinzip nutzte die Bindung von Nukleinsäuren an Glasfaseroberflächen, wie bei den Kits der Firma Qiagen besprochen.

Mit dem Machery&Nagel Nucleo Spin RNA Kit wurde entsprechend der Vorschrift "Isolierung aus biologischen Flüssigkeiten" RNA isoliert. 400 μl Puffer RA1 und 4 μl ß Mercaptoethanol wurden in einem 1.6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt. 100 μl Probe wurden hinzugefügt und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gut gemischt.

[...]

Das Machery&Nagel Nucleo Spin RNA II Kit enthielt zusätzlich DNase I und den dazugehörigen Reaktionspuffer.

Das eingesetzte Herstellerprotokoll lautete wie folgt:

400 μl Puffer RA1 und 4 μl ß Mercaptoethanol wurden in einem 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt. 100 μl Probe wurden hinzugefügt und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren

[Seite 70]

gut gemischt. Anschließend wurden 250 μl 96 % Ethanol hinzugefügt und der Isolierungsansatz auf einem Schüttler geschüttelt. Die Nucleo Spin Säule wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gegeben und mit 750 μl RNA-Isolierungsansatz beladen. Anschließend wurde 1 min bei 8000 x g zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen und die Nucleo Spin Säule in ein neues Auffanggefäß überführt und 1 min bei maximaler Zentrifugengeschwindigkeit zentrifugiert. 10 μl rekonstitutierter DNase I und 90 μl DNase-Reaktionspuffer wurden miteinander gemischt und davon 95 μl direkt auf die Nucleo Spin Säulchen-Membran pipettiert und 15 min bei 24 °C inkubiert. Anschließend wurden 500 μl Puffer RA2 auf die Nucleo Spin Säule gegeben. Es folgte 1 min Zentrifugation bei 8000 x g. Danach wurden Durchfluß und Auffanggefäß verworfen und die Nucleo Spin Säule in ein neues 2 ml Auffanggefäß umgesetzt. 600 μl Puffer RA3 wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 1 min bei 8000 x g zentrifugiert. Der Durchfluß wurde entsorgt. 250 μl Puffer RA3 wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 2 min bei Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert. Danach wurde die Nucleo Spin Säule vorsichtig in ein neues 1,6 ml Reaktionsgefäß überführt und 50 μl RNase freies Wasser dazugegeben. Die RNA wurde durch 1 min Zentrifugation bei Maximalgeschwindigkeit eluiert.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Warum kann nicht wie im Original bei einer derartigen wörtlichen Übereinstimmung auf das "Herstellerprotokoll" verwiesen werden?

Interessanterweise sind an einer Stelle gegenüber der Vorlage die Zentrifugengeschwindigkeiten vertauscht und statt 1 min mit der "maximalen Zentrifugengeschwindigkeit" wird nur bei "8000 g" zentrifugiert.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

[2.] Ad/Fragment 092 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-10 07:32:34 Singulus
Ad, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Scheibner 2000, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 92, Zeilen: 1-21
Quelle: Scheibner 2000
Seite(n): 66-67, Zeilen: 66:23-28 - 67:1-14
Das Kit basiert auf dem Prinzip, dass Nukleinsäuren in Gegenwart eines chaotropen Salzes an

Glasoberflächen binden. Ein anschließender Waschvorgang entfernt die Verunreinigungen. (VOGELSTEIN & GILLESPIE 1979; BOOM et al. 1990; COLPAN 1992).

In Anlehnung an die Originalanleitung des RNeasy Mini Kits wurde RNA folgendermaßen isoliert: 400 μl Puffer RLT und 4 μl ß-Mercaptoethanol wurden in ein 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt, 4 x 103 Zellen zugegeben und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt.

Danach wurden 400 μl 70 % Äthanol zur Probe hinzugefügt und alles durch starkes Schütteln mit einem elektrischen Schüttler gut gemischt. Die RNeasy-Säule wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gegeben und mit 700 μl des Probenansatzes beladen. Es wurde bei 7.500 x g für 15 sekunden zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Anschließend wurde der verbliebene Rest an Probenansatz auf die RNeasy-Säule gegeben und wiederum 15 sek bei 7.500 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. 700 μl Puffer RW1 wurden auf die RNeasy-Säule aufgebracht und bei 7.500 x g 15 sek zentrifugiert. Durchfluss und Auffanggefäß wurden verworfen und die RNeasy-Säule in ein neues Auffanggefäß gegeben. 500 μl Puffer RPE wurden zugegeben und bei 7.500 x g für 15 sek zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Es erfolgte eine erneute Zugabe von 500 μl Puffer RPE. Danach wurde 2 Min bei 17.000 x g. zentrifugiert, um den Puffer RPE vollständig zu entfernen. Die RNeasy-Säule wurde anschließend vorsichtig in ein steriles 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben. 50 μl RNase-freies Wasser wurden auf die RNeasy-Säule pipettiert und 1 Min bei 10.000 g. zentrifugiert.


BOOM R, SOL CJA, SALIMANS MMM, JANSEN CL, WERTHEIM-VANDILLEN PME & VAN DER NOORDAA J. (1990) :
Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids.
J. Clin. Microbiol. ,28, 495-503

COLPAN M. (1992) :
Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren.
Eur. Pat. Appl. ,17, 56-68

VOGELSTEIN B & GILLESPIE D. (1979) :
Preparative and analytical purification of DNA from agarose.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,76, 615-619

[Seite 66]

Das Kit basiert auf dem Prinzip, dass Nukleinsäuren im Gegenwart eines chaotropen Salzes an Glasoberflächen binden. Ein anschließender Waschvorgang entfernt die Verunreinigungen. (VOGELSTEIN u. GILLESPIE 1979; BOOM et al. 1990; COLPAN 1992).

In Anlehnung an die Originalanleitung des RNeasy Mini Kits wurde folgendermaßen RNA isoliert. 400 μl Puffer RLT und 4 μl ß-Mercaptoethanol wurden in ein 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt, 100 μl Probe zugegeben und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt.

[Seite 67]

Danach wurden 400 μl 70 % Ethanol zur Probe hinzugefügt und alles durch starkes Schütteln mit einem elektrischen Schüttler gut gemischt. Die RNeasy-Säule wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gegeben und mit 700 μl des Probenansatzes beladen. Es wurde bei 7500 x g 15 sek zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen. Anschließend wurde der verbliebene Rest an Probenansatz auf die RNeasy-Säule gegeben und wiederrum 15 sek bei 7500 x g zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen. 700 μl Puffer RW1 wurden auf die RNeasy- Säule aufgebracht und bei 7500 x g 15 sek zentrifugiert. Durchfluß und Auffanggefäß wurden verworfen und die RNeasy-Säule in ein neues Auffanggefäß gegeben. 500 μl Puffer RPE wurden zugegeben und bei 7500 x g 15 sek zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen. Es erfolgte eine erneute Zugabe von 500 μl Puffer RPE. Danach wurde 2 min bei Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert, um den Puffer RPE vollständig zu entfernen. Die RNeasy-Säule wurde anschließend vorsichtig in ein steriles 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben. 50 μl RNase-freies Wasser wurden auf die RNeasy-Säule pipettiert und 1 min bei Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert.


BOOM, R., SOL, C.J.A., SALIMANS, M.M.M., JANSEN, C.L., WERTHEIM-VAN DILLEN, P.M.E. u. VAN DER NOORDAA, J. (1990):
Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids.
J Clin Microbiol, 28:495-503.

COLPAN, M. (1992):
Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren.
Eur Pat Appl No 616639

VOGELSTEIN, B. u. GILLESPIE, D. (1979):
Preparative and analytical purification of DNA from agarose.
Proc Natl Acad Sci USA, 76:615-619

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan), SleepyHollow02

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