Angaben zur Quelle [Bearbeiten]
| Autor | Antje Burkert |
| Titel | Antioxidative Therapie mit Acetylcystein während der Hämodialyse – Verbesserung der endothelialen Funktion |
| Ort | Berlin |
| Jahr | 2006 |
| Anmerkung | Inaugural-Dissertation zur Erlangung der medizinischen Doktorwürde der Charité – Universitätsmedizin Berlin Campus Benjamin Franklin |
| URL | http://www.diss.fu-berlin.de/diss/servlets/MCRFileNodeServlet/FUDISS_derivate_000000002113/ |
Literaturverz. |
nein |
| Fußnoten | nein |
| Fragmente | 3 |
| [1.] Anh/Fragment 027 04 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-09-27 21:32:24 Schumann | Anh, Burkert 2006, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 27, Zeilen: 4-27 |
Quelle: Burkert 2006 Seite(n): 32, 33, Zeilen: 32: 7ff; 33: 1ff |
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| Fluoreszenzspektrophotometrie
Die Untersuchung der intrazellulären Calciumhomöostase am Beispiel isolierter Monozyten erfolgte durch Fluoreszenzspektrophotometrie. Es wurde ein Fluoreszenzspektrophotometer Fluoroskan Ascent FL von Labysystems, Helsinki, Finnland verwendet. Bei dem angewandten Verfahren handelt es sich um ein optisches Messverfahren zur Konzentrationsbestimmung fluoreszierender Substanzen anhand ihrer Absorption bzw. Extinktion monochromatischen Lichtes. Farbstoffmoleküle, die durch eine Lichtquelle wie z.B. eine Xenon-Lampe angeregt werden, absorbieren Strahlung einer bestimmten Wellenlänge. Das Xenon-Licht wird durch einen Exzitationsfilter auf eine spezifische Wellenlänge reduziert. Wird die spezifische Wellenlänge von den Farbstoffmolekülen absorbiert, überführt es diese in einen energiereicheren Zustand (Exzitationsstrahlung). Bei der Rückkehr der Moleküle aus dem angeregten Zustand in den Grundzustand wird die entsprechende Differenzenergie in Form von Photonen freigesetzt, was als Fluoreszenz bezeichnet wird (Haeckel et al., 1989). Erfolgt diese Rückkehr vom angeregten Zustand in den Grundzustand über mittlere Energiezustände, entsteht ein vollständiges Fluoreszenzspektrum (Hollemann et al., 1985). Ein Teil der Strahlungsenergie, die von den Molekülen absorbiert wird, geht als Bewegungsenergie verloren. Dies erklärt, dass die Fluoreszenz, die von dem Molekül emittiert wird, eine längere Wellenlänge als die Exzitationsstrahlung hat. Die Intensität der von dem Fluoreszenzspektrophotometer in dem Emissionsspektrum gemessenen Fluoreszenz erlaubt einen Rückschluss auf die Anzahl der in der Probe befindlichen Moleküle und somit eine Bestimmung der Konzentration. In der vorliegenden Arbeit sollte die intrazelluläre, zytosolische Calciumionenkonzentration am Beispiel isolierter Monozyten bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz fluoreszenzspektrophotometrisch bestimmt werden. |
2.7 Fluoreszenzspektrophotometrie
Die Untersuchung der intrazellulären Calciumhomöostase am Beispiel isolierter Monozyten erfolgte durch Fluoreszenzspektrophotometrie. Es wurde ein Fluoreszenzspektrophotometer Fluoroskan Ascent FL von Labysystems, Helsinki, Finnland verwendet. Bei dem angewandten Verfahren handelt es sich um ein optisches Messverfahren zur Konzentrationsbestimmung fluoreszierender Substanzen anhand ihrer Absorption bzw. Extinktion monochromatischen Lichtes. Farbstoffmoleküle, die durch eine Lichtquelle wie z.B. eine Xenon-Lampe angeregt werden, absorbieren Strahlung einer bestimmten Wellenlänge. Das Xenon-Licht wird durch einen Exzitationsfilter auf eine spezifische Wellenlänge reduziert. Wird die spezifische Wellenlänge von den Farbstoffmolekülen absorbiert, überführt es diese in einen energiereicheren Zustand (Exzitationsstrahlung). Bei der Rückkehr der Moleküle aus dem angeregten Zustand in den Grundzustand wird die entsprechende Differenzenergie in Form von Photonen freigesetzt, was als Fluoreszenz bezeichnet wird (Haeckel et al., 1989). Erfolgt diese Rückkehr vom angeregten Zustand in den Grundzustand über mittlere Energiezustände, entsteht ein vollständiges Fluoreszenzspektrum (Hollemann et al., 1985). Ein Teil der Strahlungsenergie, die von den Molekülen absorbiert wird, geht als Bewegungsenergie verloren. Dies erklärt, dass die Fluoreszenz, die von dem Molekül emittiert wird, eine längere Wellenlänge als die Exzitationsstrahlung hat. Die Intensität der von dem Fluoreszenzspektrophotometer in dem Emissionsspektrum gemessenen Fluoreszenz erlaubt einen Rückschluss auf die Anzahl der in der Probe befindlichen Moleküle und somit eine Bestimmung der Konzentration. [Seite 33] In der vorliegenden Arbeit sollte die intrazelluläre, zytosolische Calciumionenkonzentration am Beispiel isolierter Monozyten vor und nach Hämodialysebehandlung in Ab- und Anwesenheit von Acetylcystein fluoreszenzspektrophotometrisch bestimmt werden. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [2.] Anh/Fragment 028 03 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-09-27 21:33:57 Schumann | Anh, Burkert 2006, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 28, Zeilen: 3-22 |
Quelle: Burkert 2006 Seite(n): 33, Zeilen: 4ff |
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| Die fluoreszierende Eigenschaft des Calcium-sensitiven Farbstoffes Fura-2 Pentaacetoxymethylester (Calbiochem, San Diego, CA, USA) wurde sich zunutze gemacht. Dieser Fluoreszenzfarbstoff wurde in Form von lipophilem Acetoxymethylester (AM), der zellmembranpermeabel und insensitiv für Ionen ist, appliziert. Im Zytosol der Monozyten wird der Ester durch intrazelluläre Esterasen gespalten, wodurch die freie Säure des Fluoreszenzfarbstoffes gebildet wird, die ionensensitiv und nicht mehr zellmembranpermeabel ist (Moore et al., 1990).
1 ml der isolierten Monozyten wurde nach Resuspension in physiologischer Elektrolytlösung mit vier verschiedenen Caciumkonzentrationen: 0.5, 1.0, 1.5 und 2.0 mmol/L 3 Stunden, im Anschluss eine weitere Stunde mit 2 μl Farbstoff Fura-2-AM im Wasserbad bei 37°C inkubiert und anschließend bei einer Exzitationsstrahlung von 340 bzw. 485 nm mit einer Emission von 510 nm fluoreszenzspektrophotometrisch gemessen. Zur Quantifizierung der intrazellulären Calciumionenkonzentration Fura-2-AM beladener Monozyten wurde die Fluoreszenz-Ratio-Methode angewandt (Rodland et al., 1997; Scholze et al., 2005). Hierbei wird der Quotient aus der gemessenen Fluoreszenz bei 340 nm und 485 nm gebildet. Bei einer Exzitationswellenlänge von 340 nm wird die calciumgebundene Form des Farbstoffes angeregt. Mit steigender Calciumionenkonzentration kommt es zu einem Anstieg der Fluoreszenz bei 340 nm. Bei 485 nm dagegen ist die Fluoreszenz, die vom Farbstoff ausgeht, Calcium-unabhängig. Eventuelle Fehlerquellen, wie z.B. Unterschiede in der Farbstoffkonzentration oder Farbstoffverteilung innerhalb der Zellen, unterschiedliche [Zelldurchmesser, Ausbleichen oder Ausströmen des Farbstoffs werden mit Hilfe dieser Ratio Messung eliminiert.] |
Die fluoreszierende Eigenschaft des Calcium-sensitiven Farbstoffes Fura-2 Pentaacetoxymethylester (Calbiochem, San Diego, CA, USA) wurde sich zunutze gemacht. Dieser Fluoreszenzfarbstoff wurde in Form von lipophilem Acetoxymethylester (AM), der zellmembranpermeabel und insensitiv für Ionen ist, appliziert. Im Zytosol der Monozyten wird der Ester durch intrazelluläre Esterasen gespalten, wodurch die freie Säure des Fluoreszenzfarbstoffes gebildet wird, die ionensensitiv und nicht mehr zellmembranpermeabel ist (Moore et al., 1990).
1 ml der isolierten Monozyten wurde nach Resuspension in physiologischer Elektrolytlösung mit 2 μl Farbstoff Fura-2-AM für 1 Stunde bei 4°C inkubiert und anschließend bei einer Exzitationsstrahlung von 340 bzw. 485 nm mit einer Emission von 510 nm fluoreszenzspektrophotometrisch gemessen. Zur Quantifizierung der intrazellulären Calciumionenkonzentration Fura-2-AM beladener Monozyten wurde die Fluoreszenz-Ratio-Methode angewandt (Rodland et al., 1997; Scholze et al., 2005). Hierbei wird der Quotient aus der gemessenen Fluoreszenz bei 340 nm und 485 nm gebildet. Bei einer Exzitationswellenlänge von 340 nm wird die calciumgebundene Form des Farbstoffes angeregt. Mit steigender Calciumionenkonzentration kommt es zu einem Anstieg der Fluoreszenz bei 340 nm. Bei 485 nm dagegen ist die Fluoreszenz, die vom Farbstoff ausgeht, Calcium-unabhängig. Eventuelle Fehlerquellen, wie z.B. Unterschiede in der Farbstoffkonzentration oder Farbstoffverteilung innerhalb der Zellen, unterschiedliche Zelldurchmesser, Ausbleichen oder Ausströmen des Farbstoffs werden mit Hilfe dieser Ratio-Messung eliminiert. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [3.] Anh/Fragment 029 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-09-27 21:35:32 Schumann | Anh, Burkert 2006, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 29, Zeilen: 1-8 |
Quelle: Burkert 2006 Seite(n): 33, 34, Zeilen: 33: 22ff; 34: 23ff |
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| [Eventuelle Fehlerquellen, wie z.B. Unterschiede in der Farbstoffkonzentration oder Farbstoffverteilung innerhalb der Zellen, unterschiedliche] Zelldurchmesser, Ausbleichen oder Ausströmen des Farbstoffs werden mit Hilfe dieser Ratio Messung eliminiert. Jede Fura-2-AM beladene Monozytenprobe wurde in vier 100 μl umfassende Wells aufgeteilt. Zu den Wells wurde eine Calciumlösung dazuggeben [sic] und 180 s fluoreszenzspektrophotometrisch gemessen. Nach 180 s wurden die Monozyten mit 1-Oleoyl-2-Acetyl-sn-Glycerol (OAG) (Calbiochem, San Diego, CA, USA) stimuliert und für weitere 360s fluoreszenzspektrophotometrisch gemessen.
Die Messungen in der vorliegenden Arbeit wurden mit einer Exzitationswellenlänge von 380 nm bei einer Emission von 510 nm durchgeführt. |
Eventuelle Fehlerquellen, wie z.B. Unterschiede in der Farbstoffkonzentration oder Farbstoffverteilung innerhalb der Zellen, unterschiedliche Zelldurchmesser, Ausbleichen oder Ausströmen des Farbstoffs werden mit Hilfe dieser Ratio-Messung eliminiert.
Jede Fura-2-AM beladene Monozytenprobe vor und nach der Hämodialyse in Abwesenheit und Anwesenheit von Acetylcystein wurde in drei 100 μl umfassende Wells aufgeteilt und 180 s fluoreszenzspektrophotometrisch gemessen. Nach 180 s wurden 3 μl Thapsigargin (30 μmol/l; Calbiochem, San Diego, CA, USA) bzw. 3 μl einer Calciumlösung (30 mmol/l) dazugegeben und für weitere 360 s fluoreszenzspektrophotometrisch gemessen. [Seite 34] Die Messungen in der vorliegenden Arbeit wurden mit einer Exzitationswellenlänge von 380 nm bei einer Emission von 510 nm durchgeführt. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. Die Übernahme beginnt auf der Vorseite. |
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