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Angaben zur Quelle [Bearbeiten]

Autor     Mohamed N’diaye
Titel    Konstruktion und Charakterisierung einer isogenen Actinobacillus pleuropneumoniae hlyX-Mutante
Ort    Hannover
Jahr    2005
Seiten    95
Anmerkung    Aus dem Institut für Mikrobiologie Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover; INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover; Tag der mündlichen Prüfung: 26.05.2005; der erste Gutachter stimmt mit dem von Imb überein.
URN    nbn:de:gbv:95-90609
URL    http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/ndiayem_ss05.pdf95

Literaturverz.   

nein
Fußnoten    nein
Fragmente    9


Fragmente der Quelle:
[1.] Imb/Fragment 018 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2016-05-21 18:33:03 Schumann
Fragment, Gesichtet, Imb, NDiaye 2005, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes
Untersuchte Arbeit:
Seite: 18, Zeilen: 1-7
Quelle: NDiaye 2005
Seite(n): 20, 21, Zeilen: 20:29-32; 21:4-5
Eine Möglichkeit der Energieerzeugung in Abwesenheit von Sauerstoff ist eine Variation der Atmung, bei der andere Elektronenakzeptoren als Sauerstoff verwendet werden. Zu diesen Elektronenakzeptoren gehören Nitrat (NO3-), dreiwertiges Eisen (Fe3+), Sulfat (SO42-), Carbonat (CO32-) und bestimmte organische Verbindungen (MADIGAN et al. 2003). In E. coli werden viele unter anaeroben Bedingungen exprimierte Gene von den globalen Regulatoren ArcA und FNR reguliert (BAUER et al., 1999) , SHAW und GUEST 1982).

BAUER, C.,ELSEN, S., u. BIRD, T. H. (1999): Mechanisms for redox control of gene expression.Annu. Rev. Microbiol. 53, 495-523.

SHAW, D. J. u. J. R. GUEST (1982): Nucleotide sequence of the fnr gene and primary structure of the Fnr protein of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 10, 6119-6130

[Seite 20]

Eine Möglichkeit der Energieerzeugung in Abwesenheit von Sauerstoff ist eine Variation der Atmung, bei der andere Elektronenakzeptoren als Sauerstoff verwendet werden. Zu diesen Elektronenakzeptoren gehören Nitrat (NO3-), dreiwertiges Eisen (Fe3+), Sulfat (SO42-), Carbonat (CO32-) und bestimmte organische Verbindungen (MADIGAN et al. 2003).

[Seite 21]

In E. coli werden viele unter anaeroben Bedingungen exprimierte Gene vom globalen Regulator FNR reguliert (SHAW u. GUEST 1982).


MADIGAN, M. T., J. M. MARTINKO u. J. PARKER (2003): Brock: Mikrobiologie, 2. korrigierter Nachdruck. Akademischer Verlag Heidelberg ,

SHAW, D. J. u. J. R. GUEST (1982): Nucleotide sequence of the fnr gene and primary structure of the Enr protein of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 10, 6119-6130

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

"MADIGAN et al. 2003" findet sich nicht im Literaturverzeichnis von Imb.

Sichter
(Graf Isolan) Schumann

[2.] Imb/Fragment 018 25 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2016-05-21 18:33:11 Schumann
Fragment, Gesichtet, Imb, KomplettPlagiat, NDiaye 2005, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes
Untersuchte Arbeit:
Seite: 18, Zeilen: 25-31
Quelle: NDiaye 2005
Seite(n): 21, Zeilen: 5-13
Das FNR („fumarate and nitrate reduction“)-Protein von E. coli ist ein ca. 30 kDa großes Protein; es enthält vier Eisen-Schwefel-Gruppen und induziert die Expression vieler Gene, wie z. B. der DMSO-Reduktase (SPIRO und GUEST 1990; UNDEN und DUCHENE 1987; WEINER et al. 1992), die am anaeroben Stoffwechsel beteiligt sind; gleichzeitig wird die Expression von Genen, die am aeroben Metabolismus beteiligt sind, unterdrückt. Escherichia coli besitzt Enzyme zur Nutzung von DMSO und anderen Substraten als Elektronenakzeptoren und wächst unter anaeroben [Bedingungen auf Minimalmedium mit Glyzerol als Kohlenstoff- und Energiequelle sowie DMSO als terminalem Elektronenakzeptor (BILOUS und WEINER 1985).] Das FNR (fumarate and nitrate reduction)-Protein von E. coli ist ein ca. 30 kDa großes Protein; es enthält vier Eisen-Schwefel-Gruppen und induziert die Regulation vieler Gene, wie z. B. der DMSO-Reduktase (SPIRO u. GUEST 1990; UNDEN u. DUCHENE 1987; WEINER et al. 1992), die am anaeroben Stoffwechsel beteiligt sind; gleichzeitig wird die Expression von Genen, die am aeroben Metabolismus beteiligt sind unterdrückt. Escherichia coli besitzt Enzyme zur Nutzung von DMSO und anderen Substraten als Elektronenakzeptoren und wächst unter anaeroben Bedingungen auf Minimalmedium mit Glyzerol als Kohlenstoff- und Energiequelle sowie DMSO als terminalem Elektronenakzeptor (BILOUS u. WEINER 1985).
Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan) Schumann

[3.] Imb/Fragment 019 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2016-05-05 18:29:35 WiseWoman
Fragment, Gesichtet, Imb, KomplettPlagiat, NDiaye 2005, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes
Untersuchte Arbeit:
Seite: 19, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: NDiaye 2005
Seite(n): 21, 22, Zeilen: 21:10-27, 28-29, 31-34; 22:2-12
[Escherichia coli besitzt Enzyme zur Nutzung von DMSO und anderen Substraten als Elektronenakzeptoren und wächst unter anaeroben] Bedingungen auf Minimalmedium mit Glyzerol als Kohlenstoff- und Energiequelle sowie DMSO als terminalem Elektronenakzeptor (BILOUS und WEINER 1985). Die DMSO-Reduktaseaktivität kann durch die Anwesenheit von Nitrat oder Sauerstoff unterdrückt werden. Andererseits induziert anaerobes Wachstum auf DMSO als terminalem Elektronenakzeptor die Aktivität von Nitrat, Fumarat und Trimethylamin-N-Oxid Reduktase (BILOUS und WEINER 1985). Ein Abfall des Sauerstoffspiegels, aber auch andere Faktoren wie Wachstumsphase und Kohlenstoffquelle, spielen eine wichtige Rolle bei der FNR-Expression von E. coli (SOLTES und MACINNES 1994).

Das HlyX Protein von A. pleuropneumoniae ist homolog zum FNR-Protein von E. coli (JERLSTROEM et al. 1987; MACINNES et al. 1990; WOODS und GUEST 1987). Wie FNR enthält auch HlyX vier Eisen-Schwefel-Gruppen, die für das DNA-Bindungsvermögen des Proteins verantwortlich sind (GREEN und BALDWIN 1997). MACINNES et al. (1990) haben die Nukleotidensequenz des hlyX-Gens analysiert und dabei einen offenen Leserahmen mit einer Länge von 720 bp identifiziert, der von Länge und Sequenz her dem des fnr-Gens entspricht. Der offene Leserahmen kodiert für ein Protein mit einer molekularen Masse von 27,1 kDa. Der Vergleich der Nukleotidsequenz von hlyX mit der von fnr zeigt, dass beide zu 65% identisch sind. Die abgeleiteten Proteinsequenzen von FNR und HlyX sind zu 71% identisch. Vier Cysteinreste (Positionen 14, 18, 21 und 27) sind am aminoterminalen Ende von sowohl HlyX als auch FNR vorhanden. Weiterhin ist auch die Erkennungssequenz von HlyX der von FNR sehr ähnlich (15 von 18 Basen sind identisch). Die vergleichbare Aktivität von HlyX und FNR wurde auch dadurch bestätigt, dass eine FNR-Mutante mit HlyX komplementiert werden konnte (GREEN und BALDWIN 1997; MACINNES et al. 1990). Anders als das FNR-Protein war das HlyX-Protein aber in der Lage, die Synthese einer hämolytischen Aktivität bei E. coli unter anaeroben Bedingungen zu induzieren (SOLTES und MACINNES 1994); dieses Ergebnis weist auf Unterschiede der beiden Proteine in ihrem DNA-Bindungsvermögen hin. Die Anwesenheit von HlyX oder FNR sind für das Wachstum von E. coli Δfnr auf einem Glycerol-Nitrat-Minimalmedium unter anaeroben Bedingungen essentiell. Im Gegensatz dazu werden weder HlyX noch FNR beim Wachstum auf demselben Medium mit Fumarat gebraucht (SOLTES u. MACINNES 1994).

[Seite 21]

Escherichia coli besitzt Enzyme zur Nutzung von DMSO und anderen Substraten als Elektronenakzeptoren und wächst unter anaeroben Bedingungen auf Minimalmedium mit Glyzerol als Kohlenstoff- und Energiequelle sowie DMSO als terminalem Elektronenakzeptor (BILOUS u. WEINER 1985). Die DMSO-Reduktaseaktivität kann durch die Anwesenheit von Nitrat oder Sauerstoff unterdrückt werden. Andererseits induziert anaerobes Wachstum auf DMSO als terminalem Elektronenakzeptor die Aktivität von Nitrat, Fumarat und Trimethylamin-N-Oxid Reduktase (BILOUS u. WEINER 1985). Ein Abfall des Sauerstoffspiegels, aber auch andere Faktoren wie Wachstumsphase und Kohlenstoffquelle spielen eine wichtige Rolle bei der FNR-Expression von E. coli (SOLTES u. MACINNES 1994).

Das HlyX Protein von A. pleuropneumoniae ist homolog zum FNR-Protein von E. coli (JERLSTROEM et al. 1987; MACINNES et al. 1990; WOODS u. GUEST 1987). Wie FNR enthält auch HlyX vier Eisen-Schwefel-Gruppen, die für das DNA-Bindungsvermögen des Proteins verantwortlich sind (GREEN u. BALDWIN 1997). MACINNES et al. (1990) haben die Nukleotidensequenz des hlyX-Gens analysiert und dabei einen offenen Leserahmen mit einer Länge von 720 bp identifiziert, der von Länge und Sequenz her dem des fnr-Gens entspricht. Der offene Leserahmen kodiert für ein Protein mit einer molekularen Masse von 27,1 kDa. Die Nukleotidsequenz liegt unter der Zugangsnummer M34443 bei GenBank vor. Der Vergleich der Nukleotidsequenz von hlyX mit der von fnr zeigt, dass beide zu 65% identisch sind. Im hlyX-Gen sind Glycin, Isoleucin und Leucin vorwiegend durch CAA, ATT und TTA kodiert, während bei fnr GAG, ATG und CTG die häufigsten Kodierungstripletts sind. Die abgeleiteten Proteinsequenzen von FNR und HlyX sind sehr ähnlich, 71% von 239 Aminosäuren sind identisch. Vier Cysteinreste (Positionen 14, 18, 21 und 27) sind am aminoterminalen Ende von sowohl HlyX als auch FNR vorhanden. Weiterhin ist auch die Erkennungssequenz von HlyX der von FNR sehr ähnlich (15 von 18 Basen sind identisch).

[Seite 22]

Die Konsensussequenz für HlyX-Bindungsstellen ist TTGAT----ATCAA und die Erkennungssequenz von FNR ist TTGAT----ATCAG (GREEN u. BALDWIN 1997). Die vergleichbare Aktivität von HlyX und FNR wurde auch dadurch bestätigt, dass eine FNR-Mutante mit HlyX komplementiert werden konnte (GREEN u. BALDWIN 1997; MACINNES et al. 1990). Anders als das FNR-Protein war das HlyX-Protein aber in der Lage, die Synthese einer hämolytischen Aktivität bei E. coli unter anaeroben Bedingungen zu induzieren (SOLTES u. MACINNES 1994); dieses Ergebnis weist auf Unterschiede der beiden Proteine in ihrem DNA-Bindungsvermögen hin. Die Anwesenheit von HlyX oder FNR sind für das Wachstum von E. coli (Δfnr) auf einem Glycerol-Nitrat Minimalmedium unter anaeroben Bedingungen essentiell. Im Gegensatz dazu werden weder HlyX noch FNR beim Wachstum auf demselben Medium mit Fumarat gebraucht (SOLTES u. MACINNES 1994).

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan) Schumann

[4.] Imb/Fragment 020 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2016-05-21 18:35:42 Schumann
Fragment, Gesichtet, Imb, NDiaye 2005, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes
Untersuchte Arbeit:
Seite: 20, Zeilen: 1-19, 21-23
Quelle: NDiaye 2005
Seite(n): 22, Zeilen: 13 ff.
Es wird vermutet, dass A. pleuropneumoniae ein ähnliches hierarchisches System für die Expression der Gene im sauerstoffarmen Milieu wie E. coli hat (MACINNES et al. 1990). Bisher wurde gezeigt, dass die DMSO-Reduktase und die Aspartase bei A. pleuropneumoniae im ex vivo Modell (Zusatz von BALF zum Kulturmedium) hochreguliert sind und dass die kodierenden Gene über potentielle HlyX-Bindungsstellen verfügen (BALTES et al. 2003; JACOBSEN et al. 2005). Die Deletion des dmsA-Genes führt zur Attenuierung von A. pleuropneumoniae in der akuten Phase der Infektion (BALTES et al. 2003). Eine A. pleuropneumoniae-ΔaspAΔdmsA-Doppelmutante zeigte in Kultur reduziertes Wachstum unter anaeroben Bedingungen sowie einen milderen klinischen Verlauf nach Aerosol-Infektion als der Wildtypstamm und konnte nur selten in intakten Lungengeweben nachgewiesen werden (JACOBSEN et al. 2005). Der A. pleuropneumoniae Wildtypstamm konnte jedoch in großer Anzahl aus unverändertem Lungengeweben isoliert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass mit der DMSO-Reduktase und der Aspartase zwei mögliche Vertreter des HlyX-Regulons an Pathogenese und Persistenz beteiligt sind. Daraus lässt sich die Hypothese ableiten, dass HlyX-regulierte Gene allgemein von großer Bedeutung für die Pathogenese und Persistenz von A. pleuropneumoniae im Respirationstrakt sind. In der vorliegenden Arbeit sollte überprüft werden, ob möglicherweise die in der hlyX-negativen Mutante fehlende Aufregulation des äußeren Membranproteins frpB eine Rolle für die Attenuierung der Mutante spielt. Dazu sollte eine frpB-negative Mutante von A. pleuropneumoniae erstellt und im Aerosolinfektionsmodell am Schwein auf ihre Virulenz hin überprüft werden. Es wird vermutet, dass A. pleuropneumoniae ein ähnliches hierarchisches System für die Expression der Gene im sauerstoffarmen Milieu wie E. coli hat (MACINNES et al. 1990). Bisher wurde gezeigt, dass die DMSO-Reduktase und die Aspartase bei A. pleuropneumoniae im ex vivo Modell (Zusatz von BALF zum Kulturmedium) hochreguliert sind und dass die kodierenden Gene über potentielle HlyX-Bindungsstellen verfügen (BALTES et al. 2003; JACOBSEN et al. 2005). Die Deletion des dmsA-Genes führt zur Attenuierung von Actinobacillus. pleuropneumoniae in der akuten Phase der Infektion (BALTES et al. 2003). Eine A. pleuropneumoniae ΔaspAΔdmsA Doppelmutante zeigte in Kultur reduziertes Wachstum unter anaeroben Bedingungen sowie einen milderen klinischen Verlauf nach Aerosol-Infektion als der Wildtypstamm und konnte nur selten in intakten Lungengeweben nachgewiesen werden (JACOBSEN et al. 2005). Der A. pleuropneumoniae Wildtypstamm konnte jedoch in großer Anzahl aus unverändertem Lungengeweben isoliert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass mit der DMSO-Reduktase und der Aspartase zwei mögliche Vertreter des HlyX-Regulons an Pathogenese und Persistenz beteiligt sind. Daraus lässt sich die Hypothese ableiten, dass HlyX-regulierte Gene allgemein von grosser Bedeutung für die Pathogenese und Persistenz von A. pleuropneumoniae im Respirationstrakt sind. In der vorliegenden Arbeit sollte diese Hypothese überprüft werden. Dazu sollte eine hlyX-negative Mutante von A. pleuropneumoniae erstellt und im Aerosolinfektionsmodell am Schwein auf ihre Virulenz hin überprüft werden.
Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan) Schumann

[5.] Imb/Fragment 025 07 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2016-05-05 18:27:40 WiseWomanBot
Fragment, Imb, NDiaye 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, ZuSichten

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
No
Untersuchte Arbeit:
Seite: 25, Zeilen: 7-24
Quelle: NDiaye 2005
Seite(n): 24, Zeilen: 1-19
3.1.1.2 Isolierung, Reinigung und Quantifizierung von Nukleinsäuren

Im folgenden wird die gewählte Vorgehensweise beschrieben; die Zusammensetzung der verwendeten Lösungen und Puffer zur Reinigung und Quantifizierung der DNA sind im Anhang (9.2.2) aufgeführt

3.1.1.3 Präparation chromosomaler DNA von A. pleuropneumoniae

1. PPLO-Platte beimpfen und übernacht bebrüten, Koloniematerial in 2,5 ml TEPuffer resuspendieren.

2. 50 μl EDTA (0,5 M; Endkonzentration 10 mM), 250 μl SDS (10 %; Endkonzentration 1%l) und 64 μl Proteinase K (20 mg/ml; Endkonzentration 500 μg/ml) wurden hinzugegeben, gemischt und 1 Stunde bei 55°C im Wasserbad inkubiert.

3. 25-50μl RNAse (10mg/ml; 100 μg/ml Endkonzentration) vor Gebrauch 10 min bei 100°C kochen, dann auf Eis stellen; Reaktion für 30 min bei 37°C

4. Phenol (250 μl) äqulibriert mit TE-Puffer wurde hinzugefügt, gemischt (vortexen) und bei -70°C über Nacht eingefroren.

5. Das Gemisch wurde bei 55°C aufgetaut und Chloroform:Isoamylalkahol (24:1)– Gemisch (500 μl) wurde anschließend zur Trennung der Phasen dazugegeben.

6. Der Ansatz wurde bei 10.000 rpm (SA600-Rotor), bei 4°C für 5 min zentrifugiert, der Überstand wurde mit einer Plastik-Pasteurpipette entnommen und in ein neues Polypropylen-Röhrchen pipettiert.

7. Die Phenol/Chloroform Extraktion mit 500 μl (ca. 1/5 des Volumens) Chloroform:Isoamyl (24/1)-Gemisch wurde wiederholt und bei 10.000 rpm, 4°C 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Plastikröhrchen überführt.

3.3 Isolierung, Reinigung und Quantifizierung von DNA

Puffer und Lösungen zur Reinigung und Quantifizierung der DNA sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.3)

3.3.1 Präparation chromosomaler DNA von A. pleuropneumoniae

1. Bakterien von einer gut bewachsenen Platte wurden in 2,5 ml TE-Puffer resuspendiert.

2. EDTA (10 mM, 25 μl), SDS (1%, 125 μl) und Proteinase K (500 μg/ml, 32 μl) wurden zugegeben, gemischt und bei 55°C im Wasserbad inkubiert.

3. RNAse (100 μg/ml, 19 μl) wurde zugegeben und 30 min im Wasserbad 37°C inkubiert.

4. Phenol (250 μl) in TE-Puffer wurde hinzugefügt, gemischt und bei -70°C über Nacht eingefroren.

5. Das Gemisch wurde vorsichtig bei 55°C aufgetaut und Chloroform:Isoamylalkahol (24:1)–Gemisch (500 μl) wurde anschließend zur Trennung der Phasen dazugegeben.

6. Der Ansatz wurde bei 10.000 rpm (SA600-Rotor), bei 4°C für 5 min zentrifugiert, der Überstand wurde mit einer Plastik-Pasteurpipette entnommen und in ein neues Polypropylen-Röhrchen pipettiert.

7. Die Phenol/Chloroform Extraktion mit 500 μl (ca. 1/5 des Volumens) Chloroform:Isoamyl (24/1)-Gemisch wurde wiederholt und bei 10.000 rpm, 4°C 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Plastikröhrchen überführt.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan)

[6.] Imb/Fragment 026 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2016-05-21 18:39:40 Schumann
Fragment, Gesichtet, Imb, KomplettPlagiat, NDiaye 2005, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes
Untersuchte Arbeit:
Seite: 26, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: NDiaye 2005
Seite(n): 24; 27, Zeilen: 24:20-27; 27:1 ff.
8. Die DNA wurde mit 3M Na-Acetat pH 5,2 (250 μl, ca. 1/10 des Volumens) und

Isopropanol (2,5 ml, ca. 1 Volumen) ausgefällt.

9. DNA-Fasern wurden mittels einer Pipettenspitze aufgewickelt, in 70% Ethanol für 5 min gewaschen und luftgetrocknet.

10. Die DNA wurde in 200 μl A. bidest. resuspendiert.

11. Die DNA wurde anschließend im Kühlschrank über Nacht aufbewahrt.

12. Die DNA wurde durch Elektrophorese von 1 μl der Präparation auf einem Agarosegel quantifiziert.

3.1.1.4 Alkalilysis-Verfahren zur Präparation von Plasmid DNA

Drei ml Übernachtkultur (Schüttler) wurden abzentrifugiert.

1. Das Pellet wurde in 300 μl Tris-EDTA ( 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]; 10 mM EDTA, 1 mg/ml RNAse) resuspendiert.

2. Dreihundert μl NaOH-SDS-Lösung (0,2 M NaOH, 1% [w/v] SDS) wurden hinzugegeben und bis zur Lyse der Bakterien bei Raumtemperatur (längstens 3 min) inkubiert.

3. Dreihundert μl 3,2 M K-Acetat-Puffer (pH 5,5) wurden zugegeben, die Suspension wurde gründlich gemischt und für 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert.

4. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

5. Die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 600 μl eiskaltem Isopropanol bei Raumtemperatur.

6. Nach 10 min Zentrifugation bei 13.000 rpm wurde das Pellet getrocknet.

7. Das Pellet wurde in 25 μl A. dest. resuspendiert.

3.1.1.5 DNA-Aufreinigung mit “Nucleospin-Extract”

1. Das DNA Fragment wurde unter UV-Licht (280 nm) aus einem TAE-Agarosegel ausgeschnitten und gewogen.

2. 200 μl NT1-Puffer/100 mg Gel wurden zugegeben und im Wasserbad bei 55°C

für 5 bis10 min bis zum vollständigen Lösen des Gels inkubiert.

3. Das aufgelöste Gel wurde auf ein Nucleospin-Säulchen geladen, bei 10.000 rpm für 1 min zentrifugiert und die Flüssigkeit verworfen.

4. 600 μl Waschpuffer wurden zugegeben und bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugiert und das Eluat verworfen.

[Seite 24]

8. Die DNA wurde mit 3M Na-Acetat pH 5,2 (250 μl, ca. 1/10 des Volumens) und Isopropanol (2,5 ml, ca. 1 Volumen) ausgefällt.

9. DNA-Fasern wurden mittels einer Pipettenspitze aufgewickelt, in 70% Ethanol für 5 min gewaschen und luftgetrocknet.

10. Die DNA wurde in 200 μl A. bidest. resuspendiert.

11. Die DNA wurde anschließend im Kühlschrank über Nacht aufbewahrt.

12. Die DNA wurde durch Elektrophorese von 1 μl der Präparation auf einem Agarosegel quantifiziert.

[Seite 27]

3.3.2 Alkalilysis-Verfahren zur Präparation von Plasmid DNA

Drei ml Übernachtkultur (Schüttler) wurden abzentrifugiert.

1. Das Pellet wurde in 300 μl Tris-EDTA ( 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]; 10 mM EDTA, 1 mg/ml RNAse) resuspendiert.

2. Dreihundert μl NaOH-SDS-Lösung (0,2 M NaOH, 1% [w/v] SDS) wurden hinzugegeben und bis zur Lyse der Bakterien bei Raumtemperatur (längstens 3 min) inkubiert.

3. Dreihundert μl 3,2 M K-Acetat-Puffer (pH 5,5) wurden zugegeben, die Suspension wurde gründlich gemischt und für 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert.

4. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

5. Die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 600 μl eiskaltem Isopropanol bei Raumtemperatur.

6. Nach 10 min Zentrifugation bei 13.000 rpm wurde das Pellet getrocknet.

7. Das Pellet wurde in 25 μl A. dest. resuspendiert.

3.3.3 DNA-Aufreinigung mit “Nucleospin-Extract” (Macherey-NAGEL GmbH&CO. Düren Deutschland)

1. Das DNA Fragment wurde unter UV-Licht (280 nm) aus einem TAE-Agarosegel ausgeschnitten und gewogen.

2. Dreihundert μl NT1-Puffer/100 mg Gel wurden zugegeben und im Wasserbad bei 50°C bis zum vollständigen Lösen des Gels inkubiert.

3. Das aufgelöste Gel wurde auf ein Nucleospin-Säulchen geladen bei 10.000 rpm für 1 min zentrifugiert und die Flüssigkeit verworfen.

4. Fünfhundert μl NT2-Puffer wurden zugegeben und bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugiert und das Eluat verworfen.

5. Sechshundert μl NT3-Puffer wurden zugegeben, bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugiert und das Eluat verworfen.

6. Zweihundert μl NT3-Puffer wurden zugegeben und bei 13.000 rpm für 5 min zentrifugiert und das Eluat verworfen.

Anmerkungen

Reines C&P mit leichter Anpassung zum Abschluss - keine fünf Minuten Arbeitsaufwand.

Ohne jeden Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan) Schumann

[7.] Imb/Fragment 027 03 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2016-05-05 18:28:01 WiseWomanBot
Fragment, Imb, NDiaye 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, ZuSichten

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
No
Untersuchte Arbeit:
Seite: 27, Zeilen: 3-29
Quelle: NDiaye 2005
Seite(n): 27, 29-30, Zeilen: 27:29-31; 29:27-30-30:1-18
5. Das Säulchen wurde erneut für 5 Minuten zentrifugiert und das Eluat verworfen; anschließend wurde es offen für etwa 10 Minuten stehen gelassen.

7. Die Kartusche wurde in ein neues ERG überführt, 25-50 μl A. bidest. wurden hinzugegeben und die an die Matrix gebundene DNA wurde durch Zentrifugieren bei 11.000 rpm für 1 min eluiert.

3.1.2 Plasmidkonstruktion

3.1.2.1 PCR für 2.1-TOPO-Cloning

1. Zu 2 μl des PCR Produktes wurden 1 μl Salzlösung, 1 μl steriles A. dest und 1 μl Vektor 2.1- TOPO hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert.

2. Fünfzig μl kompetente E. coli-Zellen wurden in ein Reaktionsgefäß pipettiert, die oben inkubierte Lösung wurde hinzugegeben und auf Eis für 10 min stehen gelassen.

3. Das Gemisch wurde anschließend im Thermoblock bei 42°C für 20 sek. inkubiert und anschließend auf Eis gestellt.

4. Zweihundertfünfzig μl SOC-Medium (Zusammensetzung im Anhang, Kapitel 8.2) wurden nach dem Hitzeschock dazupipettiert und dann wurden die Zellen für 1 Stunde bei 37°C geschüttelt.

5. Auf LB-Platten mit Ampicillinzusatz (100 mg/ml) wurden 25 μl X-Gal Lösung (25 mg/ml [*]verdünnung [sic] mit 125 μl A. dest) ausplattiert.

6. Die Bakterien wurden auf Platten (Platte 1: 200 μl, Platte 2: 100 μl) fraktioniert ausplattiert und im Brutschrank bei 37°C über Nacht inkubiert.

7. Am nächsten Tag wurden die Platten überprüft und an weiβen Kolonien wurde eine PCR zum Nachweis des Inserts durchgeführt. Die Zusammensetzung der angewendeten Puffer ist im Anhang aufgeführt (Kapitel 8.4).

3.1.2.2 Restriktionsenzymverdaus

Die Restriktionsenzymverdaus wurden in 25 μl Ansätzen (0,5 bis 1 μg DNA pro Ansatz) durchgeführt. Die DNA wurde mit A. dest., den jeweiligen Restriktionsendonukleasen, 10 × Carlos Puffer (Anhang; Kapitel 8.4) und 10 x DTT-[Lösung (10 mM) gemischt und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert.]

[Seite 27]

7. Das Säulchen wurde in neues Reagenzgefäss überführt, 25-50 μl A. bidest. wurden hinzugegeben und 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die aufgereinigte DNA wurde durch Zentrifugieren bei 11.000 rpm für 1 min eluiert.

[Seite 29]

3.4 Plasmidkonstruktion

3.4.1 PCR® 2.1-TOPO-Cloning

1. Zu 2 μl des PCR® 2.1-TOPO -Produkts wurden 1 μl Salzlösung, 1 μl steriles A. dest und 1 μl Vektor 2.1- TOPO hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert.

[Seite 30]

2. Fünfzig μl kompetenter E. coli wurden in ein Reaktionsgefäß pipettiert, die oben inkubierte Lösung wurde hinzugegeben und auf Eis für 10 min stehen gelassen.

3. Das Gemisch wurde anschließend im Thermoblock bei 42°C für 20 sek. Inkubiert und anschlissend [sic] auf Eis gestellt.

4. Zweihundertfünfzig μl SOC-Medium (Zusammensetzung im Anhang, Chapitel 8.2) wurden nach dem Hitzeschock dazu pipettiert und dann wurden die Zellen für 1 Stunde bei 37°C geschüttelt.

5. Auf LB-Platten mit Ampicillinzusatz wurden 25 μl X-Gal Lösung (25 mg/l,Verdünnung: 25 μl X-Gal Stammlösung + 125 μl A. dest) ausplattiert.

6. Die Bakterien wurden auf Platten (Platte 1: 200 μl, Platte 2: 100 μl) ausplattiert und im Brutschrank bei 37°C über Nacht inkubiert.

7. Am nächsten Tag wurden die Platten überprüft und an weiβen Kolonien wurde eine PCR zum Nachweis des Inserts durchgeführt.

3.4.2 Restriktionsenzymverdau

Die Zusammensetzung der angewendeten Puffer sind im Anhang aufgeführt (Chapitel [sic] 8.4). Die Restriktionsenzymverdaus wurden in 25 μl Ansätzen (0,5 bis 1 μg DNA) durchgeführt. Die DNA wurde mit A. dest., den jeweiligen Restriktionsendonukleasen, 10 × Carlos Puffer und DTT-Puffer (10 mM) und BSA (1 mg/ml) gemischt und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

In der ersten Aufzählung fehlt der 6. Unterpunkt. An der durch [*] gekennzeichneten Stelle steht im Original eine "einsame" geöffnete eckige Klammer.

Imb enthält - übrigens genau wie die hier benutzte Quelle N’diaye (2005) - kein "Kapitel 8.4"; der Anhang trägt bei beiden Autoren die Nr. 9. Abschnitt 8 ist jeweils das Literaturverzeichnis.

Sichter
(Graf Isolan)

[8.] Imb/Fragment 035 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2016-05-21 18:41:36 Schumann
Fragment, Gesichtet, Imb, KomplettPlagiat, NDiaye 2005, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes
Untersuchte Arbeit:
Seite: 35, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: NDiaye 2005
Seite(n): 36-37, Zeilen: 36:26-28 - 37:1-25
2. Die Denaturierung der DNA erfolgte in Denaturierungslösung für 1 Stunde (3 x 20 min)

3. Die Neutralisation wurde in Neutralisierungslösung für 1 Stunde (3 x 20 min) vorgenommen.

4. Der Unterbau in einer Plastikschale wurde mit 2 Lagen 3MM Filterpapier bedeckt und mit Puffer bedeckt (10 × SSC) ; das Filterpapier wurde mit Puffer bedeckt.

5. Das Gel wurde mit Unterseite nach oben auf das Filterpapier gelegt.

6. Ein genügend großes Stück Tropilon–45 Membran (rundum ca. 2 mm größer als das Gel) wurde mit A. dest. angefeuchtet und unter Vermeidung von Luftblasen aufgelegt.

7. Zwei Lagen Filterpapier (2 mm < Membran) wurden trocken aufgelegt.

8. Mehrere Lagen Papierhandtücher wurden als Saugkissen aufgelegt.

9. Ca. 500 g Gewicht wurde aufgelegt (je nach Gelgröße; das Gewicht wurde so bemessen, dass Papierhandtücher gerade eben zusammengedrückt sind).

10. Nach einer Blottingdauer von 0,5-15 Stunden wurden die Auflagen entfernt.

11. Das Gel wurde mit der Membran zusammen umgedreht, die Geltaschen (mit Bleistift) und Seiten (Ecke abgeschnitten) wurden markiert.

12. Das Gel wurde abgezogen und entsorgt.

13. Die Membran wurde 5 min in 5 x SSC geschwenkt.

14. Die Membran wurde in Papierhandtüchern getrocknet und 2 Stunden bei 90°C gebacken.

15. Die gebackene Membran wurde in A. dest. angefeuchtet und in 6 x SSC Lösung für 2 min geschwenkt.

16. Die Membran wurde eingerollt und mit ausreichend Hybrisierungspuffer (50 ml) in einer Glasröhre für ca. 2 Stunden im Hybrisierungsofen inkubiert (Prähybridisierung).

17. Die Flüssigkeit wurde abgegossen, Hybrisierungspuffer (10 ml) und 5 min gekochte Gensonde (ca. 50 μl) wurden dazugegeben, und die Membran wurde über Nacht (bei ca. 60 °C) hybridisiert.

Nach Abgießen des Hybridisierungspuffers und der Sonde wurde die Membran mit 1 x SSC + 0,5 % SDS ca. 1 Stunde (Waschpuffer 3 x gewechselt) bei 60°C gewaschen. Zur Exposition der Membran auf Röntgenfilm wurde folgendermaßen vorgegangen:

[Seite 36]

2. Die Denaturierung der DNA erfolgte in Denaturierungslösung für 1 Stunde (3 x 20 min)

3. Die Neutralisation wurde in Neutralisierungslösung für 1 Stunde (3 x 20 min) vorgenommen.

[Seite 37]

4. Der Unterbau in einer Plastikschale wurde mit 2 Lagen 3MM Filterpapier bedeckt und unter Puffer gesetzt (10 × SSC) ; das Filterpapier wurde mit Puffer bedeckt.

5. Das Gel wurde mit Unterseite nach oben auf das Filterpapier gelegt.

6. Ein genügend großes Stück Tropilon–45 Membran (rundum ca. 2 mm größer als das Gel) wurde mit A. dest. angefeuchtet und unter Vermeidung von Luftblasen aufgelegt.

7. Zwei Lagen Filterpapier (2 mm < Membran) wurden trocken aufgelegt.

8. Mehrere Lagen Papierhandtücher wurden als Saugkissen aufgelegt.

9. Ca. 500 g Gewicht wurde aufgelegt (je nach Gelgrösse; das Gewicht wurde so bemessen, dass Papierhandtücher gerade eben zusammengedrückt sind).

10. Nach einer Blottingdauer von 0,5-15 Stunden wurden die Auflagen entfernt.

11. Das Gel wurde mit der Membran zusammen umgedreht, die Geltaschen (mit Bleistift) und Seiten (Ecke abgeschnitten) wurden markiert.

12. Das Gel wurde abgezogen und entsorgt.

13. Die Membran wurde 5 min in 5 x SSC geschwenkt.

14. Die Membran wurde in Papierhandtüchern getrocknet und 2 Stunden bei 90°C gebacken.

15. Die gebackene Membran wurde in A. dest. angefeuchtet und in 6 x SSC Lösung für 2 min geschwenkt.

16. Die Membran wurde eingerollt und mit ausreichend Hybrisierungspuffer (50 ml) in einer Glasröhre für ca. 2 Stunden im Hybrisierungsofen inkubiert (Prähybridisierung).

17. Die Flüssigkeit wurde abgegossen, Hybrisierungspuffer (50 ml) und 5 min gekochte Gensonde (ca. 50 μl) wurden dazugegeben, und die Membran wurde über Nacht (bei ca. 60 °C) hybridisiert.

Nach Abgießen des Hybridisierungspuffers und der Sonde wurde die Membran mit 1 x SSC + 0,5 % SDS ca. 1 Stunde (Waschpuffer 3 x gewechselt) gewaschen.

Zur Exposition der Membran auf Röntgenfilm wurde folgendermaßen vorgegangen:

Anmerkungen

Wortwörtlich; reines C&P mit minimalem Arbeitsaufwand; ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan) Schumann

[9.] Imb/Fragment 038 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2016-05-21 18:37:11 Schumann
Fragment, Gesichtet, Imb, KomplettPlagiat, NDiaye 2005, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes
Untersuchte Arbeit:
Seite: 38, Zeilen: 1-17, Tabelle 6, 18-19 (komplett)
Quelle: NDiaye 2005
Seite(n): 39-40, Zeilen: 39:26-33 - 40:1-8.Tabelle 5.9-10
22. Der Kamm wurde nach Erstarren des Gels entfernt und die verdauten Blöckchen wurden vorsichtig in die Slots eingesetzt.

23. Eine dünne Scheibe von Lambda Ladder PFG-Marker (50 μg/ml von NEB, Schwalbach, Taunus, England) wurde als Größenstandard genutzt.

24. Befüllte Slots wurden mit erwärmter Agarose versiegelt und 15 min stehen gelassen.

25. Nach Befestigung der Umrandung in der PFGE-Kammer wurde das Gel in die Kammer gelegt.

26. Der Laufpuffer wurde vorsichtig in die Kammer gegossen.

27. Das Programm wurde anschließend bei einer Temperatur von 12°C, einem Spannungsgradienten von 6 V/cm bei eingeschlossenem Winkel von 120° auf Pulszeiten von 10 bis 20 sek. (Block I, 14 Stunden) sowie von 35 bis 70 sek. (Block II, 12 Stunden) eingestellt.

28. Nach der Beendigung der Auftrennung wurde das Gel in Ethidiumbromidlösung (1:20.000; 25 μl Ethidiumbromid Stocklösung [10 mg/ml] auf 500 ml A. dest.) für 15 min gefärbt.

29. Das Entfärben erfolgte danach in A. dest. für 15 min.

[Tabelle 6: Verdau der Blöckchen]

Jeweils 1/3 Blöckchen wurde mit einem Enzym verdaut. Ansätze mit ApaI wurden jeweils bei 25°C und Ansätze mit AscI und NotI bei 37°C über Nacht inkubiert.

[Seite 39]

22. Der Kamm wurde nach Erstarren des Gels entfernt und die verdauten Blöckchen wurden vorsichtig in die Slots eingesetzt.

23. Eine dünne Scheibe von Lambda Ladder PFG-Marker ( 50 μg/ml von NEB, Schwalbach, Taunus, England) wurde als Größenstandard genutzt.

24. Befüllte Slots wurden mit erwärmter Agarose versiegelt und 15 min stehen gelassen.

25. Nach Befestigung der Umrandung in der PFGE-Kammer wurde das Gel in die Kammer gelegt.

26. Der Laufpuffer wurde vorsichtig in die Kammer gegossen.

[Seite 40]

27. Das Programm wurde anschließend bei einer Temperatur von 12°C, einem Spannungsgradienten von 6 V/cm bei eingeschlossenem Winkel von 120° auf Pulszeiten von 10 bis 20 sek. (Block I, 14 Stunden) sowie von 35 bis 70 sek. (Block II, 12 Stunden) eingestellt.

28. Nach der Beendigung der Auftrennung wurde das Gel in Ethidiumbromidlösung (1:20.000; 25 μl Ethidiumbromidstocklösung [10 mg/ml] auf 500 ml A. dest.) für 15 min gefärbt.

29. Das Entfärben erfolgte danach in A. dest. für 15 min.

[Tabelle 5: Verdau der Blöckchen]

Ansätze mit ApaI wurden jeweils bei 25°C und Ansätze mit AscI und NotI bei 37°C über Nacht inkubiert.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan) Schumann

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