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Quelle:Jis/Brand 2002

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Angaben zur Quelle [Bearbeiten]

Autor     Cyrill Brand
Titel    Etablierung einer embryonalen cDNA-Bibliothek und Klonierung eines FGFR-Homologs aus Enchytraeus coronatus (Annelida, Oligochaeta)
Jahr    2002
Anmerkung    Dissertation, Philipps-Universität Marburg, Fachbereich Biologie. Erscheinungsjahr der elektronischen Version ggf. erst 2003, siehe zwei Einträge bei der Deutschen Nationalbibliothek.
URL    http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2002/0095/pdf/z2002-0095.pdf ; http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2002/0095/

Literaturverz.   

nein
Fußnoten    nein
Fragmente    11


Fragmente der Quelle:
[1.] Jis/Fragment 030 09 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-09-30 11:59:20 Assit
Brand 2002, Fragment, Gesichtet, Jis, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 39, Zeilen: 9-12
Quelle: Brand 2002
Seite(n): 51, Zeilen: 1-4
3.12.9 Northern blot-Analyse

Northern-Blots dienen dem Nachweis einzelner RNAs mittels spezifischer Sonden. Dazu wird die RNA in einem Agarosegel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit der Sonde hybridisiert.

3.28. Northern-Blot

Northern-Blots dienen dem Nachweis einzelner RNAs mittels spezifischer Sonden. Dazu wird die RNA in einem Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit der Sonde hybridisiert.

Anmerkungen

Kurzes Fragment, in der Formulierung aber (abgesehen von der erweiterten Überschrift und der Kürzung im Text) wörtlich übereinstimmend. Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
assit

[2.] Jis/Fragment 035 25 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-12-23 09:17:28 Kybot
Brand 2002, Fragment, Jis, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel, ZuSichten

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 35, Zeilen: 26-31
Quelle: Brand 2002
Seite(n): 29, Zeilen: 3ff.
[3.12.7 PCR und RT-PCR]

Die Polymerasekettenreaktion, abgekürzt PCR (polymerase chain reaction), ist eine Methode, die die Amplifikation spezifischer DNA-Abschnitte ermöglicht. Die Voraussetzung für eine gezielte Anreicherung eines DNA-Abschnittes ist die Kenntnis flankierender Sequenzbereiche. Diese Bereiche dienen der Anlagerung synthetisch hergestellter Oligonukleotide, die der thermostabilen Taq-DNA-Polymerase ein freies 3‘-OH Ende anbieten, an dem die DNA Elongation startet.

[3.18. Polymerasekettenreaktion („PCR“)]

(Saiki et al., 1988)

Die Polymerasekettenreaktion, abgekürzt PCR (polymerase chain reaction), ist eine Methode, die die Amplifikation spezifischer DNA-Abschnitte ermöglicht. Die Voraussetzung für eine gezielte Anreicherung eines DNA-Abschnittes ist die Kenntnis flankierender Sequenzbereiche. Diese Bereiche dienen der Anlagerung synthetisch hergestellter Oligonukleotide, die der thermostabilen Taq-DNA-Polymerase ein freies 3‘OH Ende anbieten, an dem die DNA Elongation startet.


[Aus Literaturverzeichnis]

Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullies, K.B., Ehrlich, H.A. (1988). Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNAPolymerase. Science 239: 487-490

Anmerkungen

Man beachte, dass sich in der mutmaßlichen Vorlage noch der Verweis auf "Saiki et al., 1988" findet. Bei Jis (2003) findet sich kein solcher Verweis. Die Textübereinstimmungen setzen sich auf der Folgeseite fort, dort teils mit "Kochrezeptcharakter" (Materialauflistungen).

Sichter

[3.] Jis/Fragment 036 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-12-23 09:17:30 Kybot
Brand 2002, Fragment, Jis, KeineWertung, SMWFragment, Schutzlevel, ZuSichten

Typus
KeineWertung
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 36, Zeilen: 1-26
Quelle: Brand 2002
Seite(n): 29-30, Zeilen: S. 29: 9ff.; S. 30: 1ff.
Durch zyklische Wiederholungen des Denaturierungs-, Hybridisierungs- und Polymerisierungsschrittes wird eine exponentielle Amplifikation des DNA-Abschnittes erzielt. Die Reaktionsansätze umfaßten ein Volumen von 50 μl und setzten sich folgendermaßen zusammen:

Template-DNA (1–200 ng) x μl

Sense Oligonukleotide (0,01 pmol/μl-100 pmol/μl) 1 μl

Antisense Oligonukleotide (0,01 pmol/μl-100 pmol/μl) 1 μl

dNTP (2,5 mM pro dNTP) 2 μl

Magnesiumchlorid (10 mM) 1-3 μl

10x PCR Puffer5 μl

Taq-DNA-Polymerase 0.2-1 μl

Die PCR-Reaktionen wurden in einem Thermoblock nach folgendem Basisprogramm durchgeführt:

1 Denaturierung 94 °C 120 sec

2 Denaturierung 94 °C 30 sec

3 Primeranlagerung 55 °C 45 sec

4 Kettenverlängerung 72 °C 60 sec

5 2. - 4. 20-35 Zyklen

6 Kettenverlängerung 72 °C 300 sec

7 Abbruch 15°C --- ---

Die Reaktionsprodukte wurden schließlich in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die RT-PCR ist die empfindlichste Technik, um die Gegenwart oder Abwesenheit von RNAMolekülen [sic!] zu bestimmen. Außerdem ermöglicht die RT-PCR die Klonierung von seltenen Transkripten ohne die Notwendigkeit, eine cDNA Bibliothek zu konstruieren.

[Seite 29, Zeile 9ff.]

Durch zyklische Wiederholungen des Denaturierungs-, Hybridisierungs- und Polymerisierungsschrittes wird eine exponentielle Amplifikation des DNA-Abschnittes erzielt. Die Reaktionsansätze umfaßten ein Volumen von 50 μl und setzten sich folgendermaßen zusammen:

X μl Template-DNA (1–200 ng)

1 μl Sinn Oligonukleotide (0,01 pmol/μl-100 pmol/μl)

1 μl Antisinn Oligonukleotide (0,01 pmol/μl-100 pmol/μl)

2 μl dNTP (2,5 mM pro dNTP)

1-3 μl Magnesiumchlorid (10 mM)

5 μl 10x PCR Puffer

0,2-1 μl Taq-DNA-Polymerase

Die PCR-Reaktionen wurden in einem Thermoblock nach folgendem Basisprogramm durchgeführt:


[Seite 30, Zeile 1ff.]

Denaturierung 94 °C 120 sec

Denaturierung 94 °C 30 sec

Hybridisierung 55 °C 45 sec 25 - 35 Zyklen

Polymerisierung 72 °C 60 sec

Polymerisierung 72 °C 300 sec

Abbruch 8 °C ∞

Die Reaktionsprodukte wurden schließlich in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt (s.3.13.).

3.18.1. RT-PCR („Reverse Transkription"-PCR)

RT-PCR ist die empfindlichste Technik, um die Gegenwart oder Abwesenheit von RNA-Molekülen zu bestimmen.

Außerdem ermöglicht RT-PCR die Klonierung von seltenen Transkripten ohne die Notwendigkeit, eine cDNA Bibliothek zu konstruieren.

Anmerkungen

Größtenteils "Kochrezeptcharakter", jedoch kein Hinweis auf die Quelle. Die Materialauflistung (im Vergleich zur mutmaßlichen Vorlage geringfügig umgestellt) kann sicherlich nicht als "Plagiat" gewertet werden. Die Textübereinstimmungen beginnen bereits auf der Vorseite und setzen sich auf der Folgeseite weiter fort.

Das fehlende Trennzeichen ("RNAMolekülen") legt eine Copy-Paste-Arbeitsweise nahe, da in der Quelle ("RNA-Molekülen") hinter dem Trennzeichen ein Zeilenumbruch erfolgt – beim Kopieren und Einfügen (z.B. mit Strg c/Strg v in Microsoft Word) geht so das Trennzeichen ("-") verloren.

Sichter

[4.] Jis/Fragment 037 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-03-29 20:36:18 Plagin Hood
Brand 2002, Fragment, Jis, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, ZuSichten

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 37, Zeilen: 1-11
Quelle: Brand 2002
Seite(n): 30-31, Zeilen: S. 30: 14ff.; S. 31: 1ff.
Die 2-Schritt-Methode: Die cDNA-Synthese wird mit Reverser Transkriptase in einem ersten Schritt durchgeführt. Anschließend wird durch Zugabe einer entsprechenden thermostabilen Polymerase die entstandene cDNA amplifiziert.

Die 1-Schritt-Methode: cDNA-Synthese und PCR werden in einem optimierten Puffer und mit einem entsprechenden Enzym zwar nacheinander, aber ohne erneute Zugabe von Reagenzien durchgeführt. Die Zweischritt-Methode hat den Vorteil, daß man zuerst cDNA herstellt und dann noch in der eigentlichen PCR variieren kann. Dafür muß man das Reaktionsgefäß öffnen und entsprechende Reagenzien hinzugeben. Die hierbei auftretenden Fehlerquellen werden durch die Einschritt-Methode vermieden. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die 1-Schritt-Methode verwendet.

[Seite 30, Zeile 14ff.]

1.Die 2-Schritt-Methode

Die cDNA Synthese wird mit Reverser Transkriptase in einem ersten Schritt durchgeführt. Anschließend wird durch Zugabe einer entsprechenden thermostabilen Polymerase die entstandene cDNA amplifiziert.

2. Die 1-Schritt-Methode

cDNA Synthese und PCR werden in einem optimierten Puffer und mit einem entsprechenden Enzym zwar nacheinander, aber ohne erneute Zugabe von Reagenzien durchgeführt. Die Zweischritt-Methode hat den Vorteil, daß man zuerst cDNA herstellt und dann noch in der eigentlichen PCR variieren kann. Dafür muß man das Reaktionsgefäß öffnen und entsprechende

[Seite 31, Zeile 1ff.]

Reagenzien hinzugeben. Die hierbei auftretenden Fehlerquellen werden durch die Einschritt-Methode vermieden.

In der hier vorliegenden Arbeit wurden beide Methoden verwendet.

Anmerkungen

Die Textübereinstimmungen setzen sich von den Vorseiten fort. Kein Hinweis auf die Quelle.

Die Rechtschreibung ("daß" statt "dass") ist beibehalten.

Sichter

[5.] Jis/Fragment 039 29 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-12-23 09:17:35 Kybot
Brand 2002, Fragment, Jis, KeineWertung, SMWFragment, Schutzlevel, ZuSichten

Typus
KeineWertung
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 39, Zeilen: 29-31 (+ erste Zeilen Folgeseite)
Quelle: Brand 2002
Seite(n): 49, Zeilen: 7ff.
Durch die Kapillarkräfte wurde die RNA nun auf die Nylon-Membran übertragen, die dem Gel direkt auflag. Dabei diente 0.01N NaOH/3M NaCl als Transferpuffer. Die Zeit, in der die RNA vom Gel auf die Membran übertragen wurde, betrug 1 Stunde [(Thomas, 1980). Durch eine Behandlung mit dem 254 nm UV-Crosslinker bei 1.5 J/cm2 für 105 sec wurde die DNA kovalent auf der Membran fixiert.] Durch die Kapillarkräfte wurde die DNA nun auf die Membran (Hybond-N, Amersham) übertragen, die dem Gel direkt auflag. Dabei diente 10x SSC als Transferpuffer. Die Zeit, in der die DNA vom Gel auf die Membran übertragen wurde, betrug mehrere Stunden oder eine Nacht. Durch eine Behandlung mit dem UV-Crosslinker wurde die DNA kovalent auf der Membran fixiert.
Anmerkungen

Gemeinsamkeiten in Formulierungen aber keine direkte Kopie; Zahlenwerte ergänzt.

Sichter

[6.] Jis/Fragment 040 13 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-12-23 09:17:36 Kybot
Brand 2002, Fragment, Jis, KeineWertung, SMWFragment, Schutzlevel, ZuSichten

Typus
KeineWertung
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 40, Zeilen: 13-22
Quelle: Brand 2002
Seite(n): 49, 50, 60, Zeilen: 49: 22-24; 50: 1-5; 60: 25-27
Bei der Verwendung von markierten DNA-Sonden wurde die Hybridisierungstemperatur unter die Schmelztemperatur gesetzt. Bevor die Sonde zur Hybridisierungslösung gegeben wurde, wurde sie für 10 min bei 100 °C denaturiert. Die hitzedenaturierte Sonde wurde auf Eis gestellt und dann zur Hybridisierungslösung gegeben. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei der angegebenen Temperatur. Am nächsten Tag wurde die nicht gebundene Sonde entfernt. Dazu wurde die Hybridisierungslösung verworfen, die Membran zweimal 5 min bei RT in 1 x SSC, 0.1% SDS gewaschen und danach für dreimal 10 min bei 68°C in 0.5 x SSC, 0.1% SDS. Danach wurde die Membran auf mit Plastiktüten beklebten Kartons ausgelegt und mit Haushaltsfolie abgedeckt. In einer [Expositionskammer wurde die Membran auf Kodak Biomax Filmen bei -80 °C für 1-5 Tage exponiert.] [Seite 49, Zeile 22-24]

Bei der Verwendung von markierten Oligonukleotiden als Sonde wurde die Hybridisierungstemperatur unter die Schmelztemperatur gesetzt. Bevor die Sonde zur Hybridisierungslösung gegeben wurde, wurde

[Seite 50, Zeile 1-5]


sie für 10 min bei 100 °C denaturiert. Die hitzedenaturierte Sonde wurde auf Eis gestellt und dann zur Hybridisierungslösung gegeben. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei der angegebenen Temperatur. Am nächsten Tag wurde die nicht gebundene Sonde entfernt. Dazu wurde die Hybridisierungslösung verworfen, der Filter zweimal 5 min bei RT in Waschlösung I gewaschen und danach für zweimal 15 min bei der Hybridisierungstemperatur in Waschlösung II.

[Seite 60, Zeile 25-27]

Wenn die Strahlung der Filter nur gering über der Hintergrundstrahlung lag, wurden die Filter auf mit Plastiktüten beklebten Kartons ausgelegt und mit Haushaltsfolie abgedeckt. In einer Expositionskammer wurden die Filter auf Kodak Biomax Filmen bei -80 °C 1-5 Tage exponiert.

Anmerkungen

Viele Gemeinsamkeiten in den Formulierungen. Ohne Quellenangabe. Fortsetzung der Textparallelen auf der Folgeseite.

Sichter

[7.] Jis/Fragment 041 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-12-23 09:17:37 Kybot
Brand 2002, Fragment, Jis, KeineWertung, SMWFragment, Schutzlevel, ZuSichten

Typus
KeineWertung
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 41, Zeilen: 1-4
Quelle: Brand 2002
Seite(n): 50, 60, Zeilen: S. 50: 7-9; S. 60: 26-27
[In einer] Expositionskammer wurde die Membran auf Kodak Biomax Filmen bei -80 °C für 1-5 Tage exponiert. Der Film wurde mit dem ursprünglichen Gelfoto zur Deckung gebracht und auftretende Banden identifiziert. [Seite 60, Zeile 26-27]

In einer Expositionskammer wurden die Filter auf Kodak Biomax Filmen bei -80 °C 1- 5 Tage exponiert.

[Seite 50, Zeile 7-9]

Der Film wurde mit dem ursprünglichen Gelfoto zur Deckung gebracht und auftretende Banden identifiziert.

Anmerkungen

Fortsetzung von Jis/Fragment 040 13.

Sichter

[8.] Jis/Fragment 041 09 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-12-23 09:17:38 Kybot
Brand 2002, Fragment, Jis, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, ZuSichten

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 41, Zeilen: 9-14
Quelle: Brand 2002
Seite(n): 34, Zeilen: 19ff.
3.12.10 Klonierung von DNA-Fragmenten in Plasmidvektoren

[...]

Zur Klonierung von DNA-Fragmenten in Plasmidvektoren gibt es viele Möglichkeiten. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die DNA-Fragmente gerichtet kloniert, so daß sich das zu klonierende Fragment in einer bestimmten Orientierung im Vektor befindet. Hierzu müssen sowohl im Vektor als auch in dem zu klonierenden Fragment durch Restriktionsenzyme verschiedene Enden hergestellt werden. Zusätzlich wurden die DNA-Fragmente mit Hilfe eines käuflich erworbenen Reaktionssatzes (pPCR-Script) in den Vektor ligiert.

3.20. Klonierung von DNA-Fragmenten in Plasmidvektoren

Zur Klonierung von DNA-Fragmenten in Plasmidvektoren gibt es viele Möglichkeiten. DNA-Fragmente können gerichtet kloniert werden, so daß sich das zu klonierende Fragment in einer bestimmten Orientierung im Vektor befindet. Hierzu müssen sowohl im Vektor als auch in dem zu klonierenden Fragment durch Restriktionsenzyme verschiedene Enden hergestellt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe von PCR generierte DNA-Fragmente ungeachtet ihrer Orientierung in den Vektor ligiert.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Die letzten zwei Zeilen (inhaltlich losgelöst von der mutmaßlichen Vorlage) wie auch die Zeile mit der Überschrift sind in der obigen Zeilenangabe nicht mitgezählt (hier nur der Vollständigkeit halber enthalten).

Man beachte die in der Dissertation wechselnden Schreibweisen "daß" (alte Rechtschreibung) und "dass" (neue Rechschreibung). In diesem Textfragment findet, wie in der mutmaßlichen Vorlage, die alte Rechtschreibung Anwendung.

Sichter

[9.] Jis/Fragment 041 24 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-12-23 09:17:39 Kybot
Brand 2002, Fragment, Jis, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, ZuSichten

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 41, Zeilen: 24-31
Quelle: Brand 2002
Seite(n): 35-37, Zeilen: S. 35: 20-21; S. 37: 9ff.
Die entstandenen Restriktionsfragmente wurden nach Dephosphorylierung von Vektoren mit alkalischer Phosphatase gelelektrophoretisch aufgetrennt und zur weiteren Verwendung aus dem Agarosegel isoliert.

3.12.10.2 Ligation von DNA in Plasmidvektoren

Bei der Ligation von Vektor-DNA und dem zu klonierenden Fragment wurde dieses und die Vektor-DNA in bestimmten molaren Verhältnissen eingesetzt (Revie et al., 1988). Hierbei war es notwendig, zuvor auf einem Agarosegel die Konzentrationen von Vektor-DNA und dem zu klonierenden DNA-Fragment zu bestimmen. Für die [Ligation sollten Vektor und Fragment mindestens äquimolar eingesetzt werden, besser sollte jedoch das zu klonierende Fragment im Überschuß zu der Reaktion gegeben werden.]


[Aus Literaturverzeichnis:]

Revie D, Smith DW, Yee TW. 1988. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Res 16:10301-10321.

[Seite 35, Zeile 20-21]

Die entstandenen Restriktionsfragmente wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt und ggf. zur weiteren Verwendung aus dem Agarosegel isoliert (s. u.).

[Seite 36, Zeile 1]

3.20.2. Ungerichtete Klonierung von DNA in Plasmidvektoren

[Seite 37, Zeile 9ff.]

3. Ligation

Bei der Ligation von Vektor-DNA und dem zu klonierenden Fragment wurde dieses und die Vektor-DNA in bestimmten molaren Verhältnissen eingesetzt (Revie et al., 1988). Hierbei war es notwendig, zuvor auf einem Agarosegel die Konzentrationen von Vektor-DNA und dem zu klonierenden DNA-Fragment zu bestimmen. Für die Ligation sollten Vektor und Fragment mindestens äquimolar eingesetzt werden, besser sollte jedoch das zu klonierende Fragment im Überschuß zu der Reaktion gegeben werden.


[Aus Literaturverzeichnis:]

Revie, D., Smith, D.W., and Yee, T.W. (1988) Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions Nucleic Acids Res 16: 10301-10321

Anmerkungen

Fortsetzung der Textübereinstimmungen auf der Folgeseite.

Sichter

[10.] Jis/Fragment 042 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-12-24 12:23:18 Singulus
Brand 2002, Fragment, Gesichtet, Jis, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 42, Zeilen: 1-30
Quelle: Brand 2002
Seite(n): 37-38, Zeilen: S. 37: 13-26; S. 38: 1-14
[Für die] Ligation sollten Vektor und Fragment mindestens äquimolar eingesetzt werden, besser sollte jedoch das zu klonierende Fragment im Überschuß zu der Reaktion gegeben werden. In den meisten Ligationen wurde dabei ein Verhältnis von 1:2 oder 1:3 von Vektor zu Insert verwendet.

In den Ligationsansatz wurde zu 50-100 ng dephosphoryliertem Vektor ein zwei - bis dreifach molarer Überschuß an zu klonierender Insert-DNA gegeben. Der Ansatz enthielt außerdem noch 0,1 VT 10x Ligationspuffer, sowie 1 Unit T4-Ligase. Das Reaktionsvolumen betrug 20 μl. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 16°C im Kryobad. Im Anschluß daran konnte eine Transformation von kompetenten Zellen mit dem Ligationsansatz vorgenommen werden. Wurde er nicht sofort weiterverwendet, konnte er bei –20 °C eingefroren werden.

3.12.10.3 Ligation und Klonierung von PCR-Fragmenten mit Hilfe des „TOPO TA Cloning Kits“

Der "TOPO TA Cloning Kit" bietet eine spezielle Möglichkeit, um PCR-Fragmente ohne Blunt-Reaktion, Dephosphorylieren des Vektors oder DNA-Aufreinigung über ein Gel in den PCR-Script Vektor zu klonieren. Der Reagenziensatz zeichnet sich durch eine hohe Klonierungseffizienz aus.

Bei dieser Methode wird das PCR-Fragment direkt in die Ligation mit dem Vektor gegeben. Dieser ist schon geschnitten und wird durch eine Topoisomerase an der Religation gehindert. Bei der Ligation löst sich die Topoisomerase innerhalb weniger Minuten und das Fragment ligiert mit dem Vektor.

Die einzigen Voraussetzungen für diese Art der Klonierung sind eine hohe DNA -Konzentration und PCR - Fragmente mit überhängenden Enden.

PCR-Fragmente, die mit Taq-Polymerase erstellt wurden, tragen ein zusätzliches Adenosinnukleotid, das die Polymerase an die generierten PCR-Enden anhängt. Bei Pfu-Polymerase geschieht dies nicht. Diese Polymerase beendet ihre Aktivität immer ohne Überhänge. In diesem Versuch können entweder Pfu-generierte Fragmente verwendet werden, oder PCR - Fragmente, die mit Pfu - Polymerase poliert wurden. Dabei wird das überhängende A entfernt und die Fragmente liegen ebenfalls „blunt-end“ vor.

[Seite 37, Zeile 13-26]

Für die Ligation sollten Vektor und Fragment mindestens äquimolar eingesetzt werden, besser sollte jedoch das zu klonierende Fragment im Überschuß zu der Reaktion gegeben werden. In den meisten Ligationen wurde dabei ein Verhältnis von 1:2 oder 1:3 von Vektor zu Insert verwendet.

In den Ligationsansatz wurde zu 50-100 ng dephosphoriliertem Vektor ein zwei- bis dreifach molarer Überschuß an zu klonierender Insert-DNA gegeben. Der Ansatz enthielt außerdem noch 0,1 VT 10x Ligationspuffer, sowie 1 Unit T4-Ligase. Das Reaktionsvolumen betrug 20 μl. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 16 °C im Kryobad. Im Anschluß daran konnte eine Transformation von kompetenten Zellen mit dem Ligationsansatz vorgenommen werden. Wurde er nicht sofort weiterverwendet, konnte er bei –20 °C eingefroren werden.

3.20.3. Ligation und Klonierung von PCR-Fragmenten mit Hilfe des „TOPO TA Cloning Kits“

Der "TOPO TA Cloning Kit" bietet eine spezielle Möglichkeit, um PCR-Fragmente ohne Blunt-Reaktion, Dephosphorylieren des Vektors oder DNA-Aufreinigung über ein Gel in den PCR-

[Seite 38, Zeile 1-14]

Script Vektor zu klonieren. Der Reagenziensatz zeichnet sich durch eine hohe Klonierungseffizienz aus.

Bei dieser Methode wird das PCR-Fragment direkt in die Ligation mit dem Vektor gegeben. Dieser ist schon geschnitten und wird durch eine Topoisomerase an der Religation gehindert. Bei der Ligation löst sich die Topoisomerase innerhalb weniger Minuten und das Fragment ligiert mit dem Vektor.

Die einzigen Voraussetzungen für diese Art der Klonierung sind eine hohe DNA Konzentration und PCR-Fragmente mit überhängenden Enden.

PCR-Fragmente, die mit Taq-Polymerase erstellt wurden, tragen ein zusätzliches Adenosinnukleotid, das die Polymerase an die generierten PCR-Enden anhängt. Bei Pfu-Polymerase geschieht dies nicht. Diese Polymerase beendet ihre Aktivität immer ohne Überhänge. In diesem Versuch können entweder Pfu-generierte Fragmente verwendet werden, oder PCR-Fragmente, die mit Pfu-Polymerase poliert wurden. Dabei wird das überhängende A entfernt und die Fragmente liegen ebenfalls „blunt-end“ vor.

Anmerkungen

Die Textübereinstimmungen erstrecken sich über die komplette Seite ohne Quellenverweis.

Sichter
(Hood) Singulus

[11.] Jis/Fragment 086 19 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-12-23 09:17:50 Kybot
Brand 2002, Fragment, Jis, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, ZuSichten

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hood
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 86, Zeilen: 19-22, 25-27
Quelle: Brand 2002
Seite(n): 93, Zeilen: 11-16
Diese Methode wird ebenfalls dazu benutzt, um das Expressionsmuster eines spezifischen Gens darzustellen. Bei dieser Methode wird kein Fragment des zu untersuchenden Gens als Sonde markiert, sondern mittels einer RT-PCR versucht, die spezifische RNA direkt im Gewebe zu amplifizieren, [...].

Der Nachweis erfolgte über DIG-markierte Nukleotide, die bei dieser Reaktion in das Amplifikat eingebaut wurden (Komminoth & Long, 1993; Nuovo, 1996; Krams et al., 2000).

Diese Methode wird ebenfalls dazu benutzt, um das Expressionsmuster eines spezifischen Gens darzustellen. Bei dieser Methode wird kein Fragment des zu untersuchenden Gens als Sonde markiert, sondern mittels einer RT-PCR versucht, die spezifische RNA direkt im Gewebe zu amplifizieren. Der Nachweis erfolgte über DIG-markierte Nukleotide, die bei dieser Reaktion in das Amplifikat eingebaut wurden.
Anmerkungen

Trotz einiger Literaturverweise kein Hinweis auf den wohl eigentlichen Textursprung.

Sichter

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