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Quelle:Msf/Hoernschemeyer 2001

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Angaben zur Quelle [Bearbeiten]

Autor     Jörg Hörnschemeyer
Titel    Untersuchung der Lipidnachbarschaft von Sphingolipiden in Modellmembranen und Membranen kultivierter Zellen
Ort    Bonn
Jahr    2001
URL    http://d-nb.info/967235839/34

Literaturverz.   

nein
Fußnoten    nein
Fragmente    9


Fragmente der Quelle:
[1.] Msf/Fragment 001 09 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-03 04:46:44 SleepyHollow02
Fragment, Gesichtet, Hoernschemeyer 2001, KomplettPlagiat, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 1, Zeilen: 9 ff.
Quelle: Hoernschemeyer 2001
Seite(n): 3, Zeilen: 3 ff.
Membranen von eukaryotischen Zellen und ihren Organellen werden aus einer Vielzahl von verschiedenen Lipid- und Proteinmolekülen gebildet. Die Grundstruktur bilden dabei die Lipide, die in Form einer zusammenhängenden Doppelschicht von ca. 5 nm Dicke angeordnet sind. Diese wird durch nicht-kovalente Bindungen, in wässrigen Medien vor allem durch die hydrophobe Wirkung des Wassers, zusammengehalten. Die Membran stellt eine mehr oder weniger undurchlässige Barriere für die meisten wasserlöslichen Moleküle dar.

Es wird heute angenommen, dass eine typische Säugerzellmembran aus 100 bis 200 verschiedenen Lipiden zusammengesetzt ist, wobei die Gruppe der Phospholipide den Hauptbestandteil darstellt. Je nach Zelltyp variiert das Lipidmuster erheblich, und auch die Organellen besitzen dabei unterschiedliche Lipidkompositionen. Zellmembranen sind dynamische Strukturen, die auch als zweidimensionale Flüssigkeit beschrieben werden (Singer & Nicolson 1972). Innerhalb einer Membranebene können sich die meisten in ihr enthaltenen Bestandteile lateral frei bewegen, wohingegen die transversale Bewegung („flip-flop“) nur von sehr wenigen Lipidklassen spontan ausgeführt werden kann.

Ein [sic] wichtige Entdeckung zu Anfang der 1970er Jahre war die Tatsache, dass die beiden Membranhälften asymmetrisch zusammengesetzt sind (Bretscher 1973). Während Cholesterin frei zwischen den beiden Membranhälften einer Lipiddoppelschicht wechseln kann und daher in beiden Seiten zu finden ist, sind Phospholipide mit einer Phosphorylcholin-Kopfgruppe (Phosphatidylcholin (PC) und Sphingomyelin (SM)) in größerem Maße auf der exoplasmatischen bzw. endoplasmatischen Seite der Membranen lokalisiert (Bretscher & Munro 1993).


Bretscher MS. 1973. Membrane structure: some general principles. Science 181(100):622-9

Bretscher MS, Munro S. 1993. Cholesterol and the Golgi apparatus. Science 261(5126):1280-1

Singer SJ, Nicolson GL. 1972. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science 175(23):720-31

Membranen von eukaryontischen Zellen und ihren Organellen werden aus einer Vielzahl von verschiedenen Lipid- und Proteinmolekülen gebildet. Die Grundstruktur bilden dabei die Lipide, die in Form einer zusammenhängenden Doppelschicht von ca. 5 nm Dicke angeordnet sind. Diese wird durch nicht-kovalente Bindungen, in wässrigen Medien vor allem durch die hydrophobe Wirkung des Wassers, zusammengehalten. Die Membran stellt eine mehr oder weniger undurchlässige Barriere für die meisten wasserlöslichen Moleküle dar. [...]

Es wird heute angenommen, dass eine typische Säugerzellmembran aus 100 bis 200 verschiedenen Lipiden zusammengesetzt ist, wobei die Gruppe der Phospholipide den Hauptbestandteil darstellt. Je nach Zelltyp variiert das Lipidmuster erheblich, und auch die darin enthaltenen Organellen besitzen dabei unterschiedliche Lipidkompositionen. Zellmembranen sind dynamische Strukturen, die auch als zweidimensionale Flüssigkeit beschrieben werden (Singer und Nicholson [sic], 1972). Innerhalb einer Membranebene können sich die meisten in ihr enthaltenen Bestandteile lateral frei bewegen, wohingegen die transversale Bewegung („flip-flop“) nur von sehr wenigen Lipidklassen spontan ausgeführt werden kann. [...]

Ein [sic] wichtige Entdeckung zu Anfang der 1970er Jahre war die Tatsache, dass die beiden Membranhälften asymmetrisch zusammengesetzt sind (Bretscher, 1973). Während Cholesterol frei zwischen den beiden Membranhälften einer Lipiddoppelschicht wechseln kann und daher in beiden Seiten zu finden ist (Bretscher und Munro, 1993), sind Phospholipide mit einer Phosphorylcholin-Kopfgruppe (Phosphatidylcholin (PC) und Sphingomyelin (SM)) in größerem Maße auf der extrazellulären bzw. luminalen Hälfte der Membranen lokalisiert.


Bretscher, M.S. (1973) Membrane structure : Some general principles. Science 181, 622-629

Bretscher, M.S. und Munro, S. (1993) Cholesterol and the golgi apparatus. Science 261, 1280- 1281

Singer, S.J. und Nicholson [sic], G.L. (1972) The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science 175, 720-731

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Auch Fehler werden übernommen ("Ein wichtige Entdeckung").

Änderungen beschränken sich auf Synonyme: Cholesterol/Cholesterin, eukaryotisch/eukaryontisch. "Nicholson" wird zu "Nicolson" korrigiert.

Sichter
(SleepyHollow02) Singulus

[2.] Msf/Fragment 002 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-06-28 11:32:01 Singulus
Fragment, Gesichtet, Hoernschemeyer 2001, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 2, Zeilen: 1 ff. (kpl.)
Quelle: Hoernschemeyer 2001
Seite(n): 3 f., Zeilen: 3:30 ff.; 4: 1 ff.
Hingegen sind Lipide wie Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylethanolamin (PE) vorwiegend auf der endoplasmatischen Seite orientiert. Die Asymmetrie der Phospholipide wird bereits an ihrem Syntheseort, dem endoplasmatischen Retikulum (ER), erzeugt. Hier werden durch einen protein-vermittelten Transport mittels der ATPabhängigen Aminophospholipid-Translokase spezifisch PE und PS auf die inneren Membranseite befördert (Bretscher & Munro 1993).

Glykosphingolipide (GSL), mit Ausnahme des Glukosylceramides (GlcCer), sind auf der exoplasmatischen Seite angeordnet (Gahmberg & Hakomori 1973). Die asymmetrische Verteilung der Glykosphingolipide und des Sphingomyelins in Membranen ist durch die Topologie der Synthese zu erklären, die, mit Ausnahme des GlcCers, im Lumen des Golgi-Apparates stattfinden (Schwarzmann & Sandhoff 1990). Da die GSL nicht in der Lage sind, durch transversale Diffusion spontan in die jeweils andere Lipidschicht von Membranen zu gelangen, wird diese asymmetrische Ausrichtung auch bei einem vesikulären Transport zu anderen Organellen oder zur Plasmamembran beibehalten. Beim GlcCer wird davon ausgegangen, dass ein protein-vermittelter Transport ins Lumen des Golgi existiert, da die Synthese des GlcCers auf der zytosolischen Seite des Golgi-Apparates stattfindet (Coste et al., 1986, Coste et al., 1985).

[Abbildung]

Abbildung 1: Modell der biologischen Zellmembran (Karlson et al., 1984)

Hingegen sind Lipide wie Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylethanolamin (PE) vorwiegend auf der zytosolischen Seite orientiert. Die Asymmetrie der Phospholipide wird bereits an ihrem Syntheseort, dem endoplasmatischen Retikulum (ER), erzeugt. Hier werden durch einen protein-vermittelten Transport mittels der ATPabhängigen Aminophospholipid-Translokase spezifisch PE und PS auf die andere Membranseite befördert (Übersicht in Devaux und Zachowski, 1994).

[Seite 4:]

Glykosphingolipide (GSL), mit Ausnahme des Glucosylceramides (GlcCer), sind auf der nicht-zytosolischen Seite angeordnet (Gahmberg und Hakomori, 1973; Hakomori, 1975). Die asymmetrische Verteilung der Glykosphingolipide und des Sphingomyelins in Membranen ist durch die Topologie der Synthese zu erklären, die, mit Ausnahme des GlcCers, im Lumen des Golgi-Apparates stattfindet (Schwarzmann und Sandhoff, 1990). Da die GSL nicht in der Lage sind, durch transversale Diffusion spontan in die jeweils andere Lipidschicht von Membranen zu gelangen, wird diese asymmetrische Ausrichtung auch bei einem vesikulären Transport zu anderen Organellen oder zur Plasmamembran beibehalten. Beim GlcCer wird davon ausgegangen, dass ein protein-vermittelter Transport ins Lumen des Golgi existiert, da die Synthese des GlcCers auf der zytosolischen Seite des Golgi-Apparates stattfindet (Coste et al., 1985, 1986).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Singulus

[3.] Msf/Fragment 003 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-06-28 11:44:48 Singulus
Fragment, Gesichtet, Hoernschemeyer 2001, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 3, Zeilen: 1-5, 7-8, 11-17, 23ff
Quelle: Hoernschemeyer 2001
Seite(n): 6, Zeilen: 1ff.
1.2 Mikrodomänen bzw. Rafts und Caveolae

Dynamische Assoziate von Cholesterin und Sphingolipiden werden als detergenzresistente Mikrodomänen oder auch „Lipid Rafts“ beschrieben, die sich in der exoplasmatischen Seite von zellulären Membranen bilden (Brown & London 1998). Diese können vermutlich floßartig in cholesterinärmeren Regionen der Plasmamembran „schwimmen“ (Kurzchalia & Parton 1999). Diese Mikrodomänen sind hauptsächlich in der Plasmamembran von Zellen lokalisiert, werden z.T. aber auch im Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) (Keller & Simons 1998) in Phagosomen (Desjardins et al., 1994, Dermine et al., 2001), in Endosomen und Lysosomen (Gagescu et al., 2000, Gruenberg 2001), im ER (Bagnat et al., 2000), in Lipid Droplets (Fujimoto et al., 2001) und in inneren Membranen, wie der Golgi-Membran, gefunden (Gkantiragas et al., 2001). Es wird angenommen, dass hier die Partitionierung der Membranbereiche entsteht. Diese Domänen können selektiv Proteine ein- oder ausschließen und somit Protein-Protein- oder Protein-Lipid-Wechselwirkungen leiten.

Über die Größe der Mikrodomänen werden derzeit sehr unterschiedliche Aussagen gemacht. In der Regel sind pro Raft 10 bis 30 Proteine eingelagert. Ein Raft selbst misst circa 50-100 nm im Durchmesser, das entspricht ungefähr 3500 Sphingomyelin-Molekülen (Simons & Ikonen 2000). Die Größe hängt aber auch vom Cholesterin- und Sphingolipidgehalt der Zelle ab. Weiterhin wird eine Zusammenlagerung von Rafts durch Protein-Protein-Interaktionen zwischen einzelnen Rafts diskutiert.

Die heterogene Lipidverteilung in funktionell spezialisierten Membranbereichen wurde zuerst in Zellen untersucht, die bereits anatomisch verschiedene Membrandomänen tragen. Polarisierte Zellen besitzen eine dem Gefäßlumen zugewandte, apikale Membran, die durch „tight junctions“ von der die Zelle umgebenden basolateralen Membran abgegrenzt wird. Simons und van Meer postulierten 1988 nach Untersuchung von polarisierten MDCK-Epithelzellen (Madine-Darby canine kidney cells), dass der hohe Gehalt an Glykosphingolipiden in der apikalen Membran durch ein „Sorting“ im Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) und einen unterschiedlichen Transport der apikalen und basolateralen Vesikel gesteuert werden muss. Gestützt wurde diese Theorie durch die Beobachtung, dass bestimmte Proteine, die mit einem Glykosyl-phosphatidyl-inositol (GPI)-[Anker in der exoplasmatischen Schicht lokalisiert sind, sich in bestimmten Membranbereichen der apikalen Membran aufhalten, die durch Detergenz-unterstützte Extraktionen isoliert werden kann.]

2.2 Mikrodomänen bzw. „Rafts“ und Caveolae

Dynamische Assoziate von Cholesterol und Sphingolipiden werden als Mikrodomänen oder auch „rafts“ beschrieben, die sich in der exoplasmatischen Seite von zellulären Membranen bilden (Simons und Ikonen, 1997). Dabei sind sie hauptsächlich in der Plasmamembran von Zellen lokalisiert, werden z.T. aber auch in inneren Membranen, wie der Golgi-Membran, gefunden (Gkantiragas et al., 2001). Es wird angenommen, dass hier die Partitionierung der Membranbereiche entsteht. Diese Domänen können selektiv Proteine ein- oder ausschließen und somit Protein-Protein- oder Protein-Lipid-Wechselwirkungen leiten. Über die Größe der Mikrodomänen werden derzeit sehr unterschiedliche Aussagen gemacht. Dabei reichen die Angaben je nach angewandter Untersuchungsmethode von ca. 30 bis 500 nm (vgl. nachfolgender Abschnitt). Die heterogene Lipidverteilung in funktionell spezialisierten Membranbereichen wurde zuerst in Zellen untersucht, die bereits anatomisch verschiedene Membrandomänen tragen. Polarisierte Zellen besitzen eine dem Gefäßlumen zugewandte, apikale Membran, die durch „tight junctions“ von der die Zelle umgebenden basolateralen Membran abgegrenzt wird. Simons und van Meer postulierten 1988 nach Untersuchung von polarisierten MDCK-Epithelzellen (Madine-Darby canine kidney cells), dass der hohe Gehalt an Glykosphingolipiden in der apikalen Membran durch ein „Sorting“ im Trans- Golgi-Netzwerk (TGN) und einen unterschiedlichen Transport der apikalen und basolateralen Vesikel gesteuert werden muss. Gestützt wurde diese Theorie durch die Beobachtung, dass bestimmte Proteine, die mit einem Glykosyl-phosphatidyl-inositol (GPI)-Anker in der exoplasmatischen Schicht lokalisiert sind, sich in bestimmten Membranbereichen der apikalen Membran aufhalten, die durch Detergenz-unterstützte Extraktionen isoliert werden können (Brown und Rose, 1992).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Nicht der Quelle zuzuordnende Teile sind nicht als Plagiat gewertet.

Sichter
(SleepyHollow02) Singulus

[4.] Msf/Fragment 004 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-06-28 17:41:34 Schumann
Fragment, Gesichtet, Hoernschemeyer 2001, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 4, Zeilen: 1-12,14ff.
Quelle: Hoernschemeyer 2001
Seite(n): 6 f., Zeilen: 6: 20 ff.; 7: 1 ff.
[Gestützt wurde diese Theorie durch die Beobachtung, dass bestimmte Proteine, die mit einem Glykosyl-phosphatidyl-inositol (GPI)-] Anker in der exoplasmatischen Schicht lokalisiert sind, sich in bestimmten Membranbereichen der apikalen Membran aufhalten, die durch Detergenz-unterstützte Extraktionen isoliert werden kann.

Es wird davon ausgegangen, dass Cholesterin die Membranen durch seine Interkalation zwischen den Lipiden über Wasserstoffbrückenbindungen verdichtet und diese somit für kleine Moleküle undurchlässiger macht. Dabei bildet es mit den Sphingolipiden besonders feste Assoziate, so dass hierbei Membranbereiche mit anderen Eigenschaften als den bereits gut untersuchten flüssig-kristallinen (bzw. „liquid-disordered, ld“) bzw. den Gel-Phasen entstehen (Brown & Rose 1992). Diese sogenannte „liquid-ordered (lo) phase“ wird als Zustand für die Mikrodomänen beschrieben, in der die Acylketten der Lipide ähnlich wie in der Gel-Phase gestreckt und dichter gepackt sind, und mehr gesättigte Kohlenwasserstoffketten aufweisen als die Phospholipide in der flüssig-kristallinen Phase der übrigen Lipidschicht, aber dennoch eine hohe laterale Mobilität besitzen (Brown & London 1998).

In den letzten Jahren sind eine Vielzahl von Beispielen beschrieben worden, an denen die Rafts als Plattformen beteiligt sind, z.B. beim „Sorting“ von Lipiden und Proteinen (Ikonen & Parton 2000), in der Signaltransduktion (Simons & Toomre 2000) und in der Internalisierung von Bakterien und Viren (Shin & Abraham 2001). Dabei konnte besonders häufig die Anreicherung von GPI-verankerten Proteinen in den Mikrodomänen nachgewiesen werden. Auch GSL werden vermehrt in diesen exoplasmatischen Membranbereichen gefunden, wohingegen auf der zytosolisch-orientierten Seite z.B. Tyrosin-Kinasen der Src-Familie und auch die α-Untereinheit von heterotrimeren G-Proteinen lokalisiert sind (Abbildung 2). Die Lipidzusammensetzung dieser zytosolisch-orientierten Membranhälfte der Rafts ist noch nicht ausreichend gut charakterisiert worden, wenn sich auch Hinweise ergeben haben, dass hier eine Anreicherung von Phosphoglycerolipiden mit gesättigten Fettsäureresten und Cholesterin vorliegt (Fridriksson et al., 1999). Auch aus niederen Eukaryoten wie Hefen, die keine polarisierte Architektur besitzen, ist die Existenz von Sterol-Sphingolipid-reichen Domänen bekannt (Bagnat et al., 2000). In diesen wird Ergosterol, ein dem Cholesterin verwandtes Molekül, in das Raft eingebaut.

Gestützt wurde diese Theorie durch die Beobachtung, dass bestimmte Proteine, die mit einem Glykosyl-phosphatidyl-inositol (GPI)-Anker in der exoplasmatischen Schicht lokalisiert sind, sich in bestimmten Membranbereichen der apikalen Membran aufhalten, die durch Detergenz-unterstützte Extraktionen isoliert werden können (Brown und Rose, 1992). Es wird davon ausgegangen, dass Cholesterol die Membranen durch seine Interkalation zwischen den Lipiden verdichtet. Dabei bildet es mit den Sphingolipiden besonders feste Assoziate, so dass hierbei Membranbereiche mit anderen Eigenschaften als den bereits gut untersuchten flüssig-kristallinen (bzw. „liquid-disordered, ld“) bzw. den Gel-Phasen entstehen. Diese sogenannte „liquid-ordered (lo) phase“ wird als Zustand für die Mikrodomänen beschrieben, in der die Acylketten der Lipide ähnlich wie in der Gel-Phase gestreckt und dichter gepackt sind, aber dennoch eine hohe laterale Mobilität besitzen (Brown und London, 1998). In den letzten Jahren sind eine Vielzahl von Beispielen beschrieben worden, an denen die „rafts“ als Plattformen beteiligt sind, z.B. beim „Sorting“ von Lipiden und Proteinen (Übersicht in Ikonen, 2001), in der Signaltransduktion (Übersicht in Simons und Toomre, 2000) und in der Internalisierung von Bakterien und Viren (Übersicht in Shin und Abraham, Einleitung 7 2001). Dabei konnte besonders häufig die Anreicherung von GPI-verankerten Proteinen in den Mikrodomänen nachgewiesen werden. Auch GSL werden vermehrt in diesen exoplasmatischen Membranbereichen gefunden, wohingegen auf der zytosolisch-orientierten Seite z.B. Tyrosin-Kinasen der src-Familie und auch die α-Untereinheit von heterotrimeren G-Proteinen lokalisiert sind (Abb. 1.2). Die Lipidzusammensetzung dieser zytosolisch- orientierten Membranhälfte der „rafts“ ist noch nicht ausreichend gut charakterisiert worden, wenn sich auch Hinweise ergeben haben, dass hier eine Anreicherung von Phosphoglycerolipiden mit gesättigten Fettsäureresten und Cholesterol vorliegt (Fridriksson et al., 1999). Auch aus niederen Eukaryonten wie Hefen, die keine polarisierte Architektur besitzen, ist die Existenz von Sterol-Sphingolipid-reichen Domänen bekannt (Bagnat et al., 2000). In diesen wird Ergosterol, ein dem Cholesterol verwandtes Molekül, in die „rafts“ eingebaut.
Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Singulus

[5.] Msf/Fragment 005 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-06-29 09:44:30 Singulus
Fragment, Gesichtet, Hoernschemeyer 2001, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 5, Zeilen: 1-7, 9-11, 13-21
Quelle: Hoernschemeyer 2001
Seite(n): 7-8, Zeilen: 13 ff.
Anders als die ebenen Membranbereiche der Rafts sind Caveolae (von cave=Höhle) als 50-100 nm große kolbenförmige Einstülpungen (Invaginationen) der Membranen im Elektronenmikroskop sichtbar (Rothberg et al., 1992), Übersicht in (Anderson 1998). Die bereits in den 1950er Jahren von Palade und Yamada morphologisch nachgewiesenen Caveolae besitzen eine nahezu gleiche Lipid- und Proteinzusammensetzung wie die zuvor beschriebenen Mikrodomänen (Palade 1953). Diese werden ebenfalls aus Cholesterin und Sphingolipiden, bestehend aus Sphingomyelin und Glykoshpingolipiden, gebildet.

Im Gegensatz zu den Rafts, wo keine Beteiligung von Strukturproteinen gefunden wurde, konnten bei den Caveolae die Transmembranproteine Caveolin-1,-2 und -3 als strukturbildende Elemente identifiziert werden (Anderson 1998). Caveoline stellen eine Familie palmitoylierten integraler Membranproteine dar, welche eine molekulare Masse von 21–25 kDa aufweisen. Diese sind Cholesterin-bindende Proteine und werden als homo- und heterooligomere Komplexe in vielen Zelltypen exprimiert. Dabei bilden die Caveolin-Oligomere Haarnadelstrukturen aus, die zur Krümmung der Membranen führen (Abbildung 2).

[Abbildung]

Abbildung 2: Modell für die Anordnung der Rafts und Caveolae in der Plasmamembran von eukaryontischen Zellen. Glykolipidreiche Domänen sind getrennt von anderen Bereichen der Membran (grau). Einzelne Lipide oder Proteine können sich zwischen den Domänen oder anderen Regionen, auch den Caveolae, der Doppelschicht lateral bewegen.

Anders als die ebenen Membranbereiche der „rafts“ sind Caveolae als 50-100 nm große Einstülpungen (Invaginationen) der Membranen im Elektronenmikroskop sichtbar (Rothberg et al., 1992, Übersicht in Anderson, 1998). Die bereits in den 1950er Jahren von Palade und Yamada morphologisch nachgewiesenen Caveolae besitzen eine nahezu gleiche Lipid- und Proteinzusammensetzung wie die zuvor beschriebenen Mikrodomänen. Im Gegensatz zu den „rafts“, wo keine Beteiligung von Strukturproteinen gefunden wurde, konnten bei den Caveolae die Proteine Caveolin-1, -2 und -3 als strukturbildende Elemente identifiziert werden. Dieses sind Cholesterol-bindende Proteine und werden als homo- und heterooligomere Komplexe in vielen Zelltypen exprimiert (besonders häufig in Fibroblasten, Adipozyten, Endothel- und Epithelzellen, sowie in Muskelzellen vor allem Caveolin-3). Dabei bilden die Caveolin-Oligomere Haarnadelstrukturen aus, die zur Krümmung der Membranen führen (Abb. 1.2). [...]

[Seite 8]

[Abbildung]

Abb. 1.2: Modell für die Anordnung der „rafts“ und Caveolae in der Plasmamembran von eukaryontischen Zellen. Glykolipid-reiche Domänen (rot) sind getrennt von anderen Bereichen der Membran (grau). Im vergrößerten Ausschnitt wird auch ein Transmembranprotein (z.B. Haemagglutinin aus dem Influenza Virus) gezeigt, welches ebenfalls in den „rafts“ nachgewiesen wurde. Einzelne Lipide oder Proteine können sich zwischen den Domänen oder anderen Regionen, auch den Caveolae, der Doppelschicht lateral bewegen.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Zwei eingestreute Sätze, die nicht der Quelle zugeordnet werden können, sind nicht als Plagiat gewertet.

Sichter
(SleepyHollow02) Singulus

[6.] Msf/Fragment 009 27 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-06-29 08:58:59 Singulus
Fragment, Gesichtet, Hoernschemeyer 2001, KomplettPlagiat, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 9, Zeilen: 27-31
Quelle: Hoernschemeyer 2001
Seite(n): 8, Zeilen: 1-4
1.5 Methoden zur Untersuchung von Rafts

Um Zusammensetzung und Eigenschaften der Moleküle innerhalb der Rafts untersuchen und charakterisieren zu können, werden verschiedene Methoden verwendet, deren Aussagekraft aufgrund der Entstehungsmöglichkeit von Artefakten z.T. kontrovers diskutiert wird.

2.2.1 Methoden zur Untersuchung von „rafts“

Um Zusammensetzung und Eigenschaften der Moleküle innerhalb der „rafts“ untersuchen und charakterisieren zu können, werden verschiedene Methoden verwendet, deren Aussagekraft aufgrund der Entstehungsmöglichkeit von Artefakten z.T. kontrovers diskutiert wird.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Unterschiede beschränken sich auf die Gliederungsnummerierung.

Sichter
(SleepyHollow02) Singulus

[7.] Msf/Fragment 010 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-06-29 08:51:46 Singulus
Fragment, Gesichtet, Hoernschemeyer 2001, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 10, Zeilen: 1 ff. (kpl.)
Quelle: Hoernschemeyer 2001
Seite(n): 8-9, Zeilen: 6 ff.; 1 ff.
Lichtmikroskope haben eine physikalisch-bedingte Auflösungsgrenze von ca. 200 nm. Da die Durchmesser der Mikrodomänen allerdings in den meisten Fällen vermutlich unterhalb dieses Bereiches liegen, werden hiermit voraussichtlich keine näheren Informationen bezüglich der in vivo-Vorgänge innerhalb solcher Rafts erhalten werden können. Daher wurden in den letzten Jahren neue Methoden entwickelt, die es erlauben sollen, diese Wechselwirkungen unter nativen Bedingungen zu untersuchen. Dabei wurden unter anderem Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Messungen (Varma & Mayor 1998, Mayor et al., 1998), die Photonen-Kraft-Mikroskopie (Pralle et al., 2000) und die „Single fluorophore tracking“-Mikroskopie angewandt (Schutz et al., 2000). Bei allen diesen Untersuchungen wurden Werte für die Durchmesser der Mikrodomänen ermittelt, die im Bereich von nur ca. 50-100 nm liegen.

[Abbildung]

Abbildung 4: Modelle für die Anordnung der in Rafts enthaltenen Moleküle in einfachen Assoziaten, sowie in Mikrodomänen vor und nach Quervernetzung (Jacobsen 1999).

Einige andere der zur Charakterisierung von Rafts angewandten Methoden basieren auf dem Quervernetzen von Molekülen, die als Bestandteile der Domänen postuliert werden. So wurde eine chemische Quervernetzung von GPI-verankerten Proteinen (Friedrichson & Kurzchalia 1998), eine Kopplung von an Raft beteiligten Proteinen mittels Antikörpern (Harder et al., 1998, Janes et al., 1999) oder auch die Immuno-Elektronen-Mikroskopie angewandt, um Wechselwirkungen innerhalb dieser Bereiche zu untersuchen. Dass hierbei u.U. auch Artefakte durch die Anwendung solcher Verfahren entstehen können, wird in [Abbildung 4 deutlich.]

Lichtmikroskope haben eine physikalisch-bedingte Auflösungsgrenze von ca. 200 nm. Da die Durchmesser der Mikrodomänen allerdings in den meisten Fällen vermutlich unterhalb dieses Bereiches liegen, werden hiermit voraussichtlich keine näheren Informationen bezüglich der in vivo-Vorgänge innerhalb solcher „rafts“ erhalten werden können. Daher wurden in den letzten Jahren neue Methoden entwickelt, die es erlauben sollen, diese Wechselwirkungen unter nativen Bedingungen zu untersuchen. Dabei wurden unter anderem Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Messungen (Varma und Mayor, 1998, Kenworthy et al., 2000), die Photonen-Kraft-Mikroskopie (Pralle et al., 2000) und die „Single fluorophore tracking“-Mikroskopie (Schutz et al., 2000) angewandt. Bei allen diesen Untersuchungen wurden Werte für die Durchmesser der Mikrodomänen ermittelt, die im Bereich von nur ca. 25-100 nm liegen.

[Seite 9:]

Einige andere der zur Charakterisierung von „rafts“ angewandten Methoden basieren auf dem Quervernetzen von Molekülen, die als Bestandteile der Domänen postuliert werden. So wurde eine chemische Quervernetzung von GPI-verankerten Proteinen (Friedrichson und Kurzchalia, 1998), eine Kopplung von an „raft“ beteiligten Proteinen mittels Antikörpern (Harder et al., 1998; Janes et al., 1999) oder auch die Immuno-Elektronen-Mikroskopie (Wilson et al., 2000) angewandt, um Wechselwirkungen innerhalb dieser Bereiche zu untersuchen. Dass hierbei u.U. auch Artefakte durch die Anwendung solcher Verfahren entstehen können, soll die Abbildung 1.3 verdeutlichen. [...]

[Abbildung]

Abb. 1.3: Modelle für die Anordnung der in „rafts“ enthaltenen Moleküle in einfachen Assoziaten, sowie in Mikrodomänen vor und nach Quervernetzung. Modifiziert nach: K. Jacobsen und C. Dietrich (1999), Trends Cell. Biol., 3, 87-91.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Singulus

[8.] Msf/Fragment 011 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-06-29 08:39:22 Singulus
Fragment, Gesichtet, Hoernschemeyer 2001, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 11, Zeilen: 1 ff. (kpl.)
Quelle: Hoernschemeyer 2001
Seite(n): 9-10, Zeilen: 7ff.; 1 ff.
[Dass hierbei u.U. auch Artefakte durch die Anwendung solcher Verfahren entstehen können, wird in] Abbildung 4 deutlich. In der rechten unteren Grafik wird eine mögliche Quervernetzung mehrerer Mikrodomänen miteinander durch die Anbindung von bifunktionellen Antikörpern bzw. chemischen Substraten gezeigt.

Als eine Möglichkeit zur Isolation von Rafts aus Zellen wird die Detergenz-unterstützte Lyse bei 4°C mit anschließender Ultrazentrifugation angewendet. Dieses von Brown und Rose (1992) entwickelte Verfahren basiert auf der Verwendung eines Lysis-Puffers, welcher bis zu 1% Triton-X-100 enthält. Dabei werden Mikrosomen und liposomale Körperchen von den in den Mikrodomänen enthaltenen Lipiden und Proteinen ausgebildet, die in 40%-iger Saccharose eine niedrige Dichte besitzen und somit im Dichtegradienten in oberen [sic] Bereiche des Zentrifugenröhrchens „schweben“ (London & Brown 2000).

Es konnte nachgewiesen werden, dass bei 37°C keine „schwimmende Fraktion“ mehr erhalten wird, so dass man davon ausgehen kann, dass hierbei die Zelllyse vollständig war und Mikrodomänen bzw. Liposomenbildung durch die Detergenzwirkung aufgelöst bzw. verhindert wurden. So konnte weiterhin gezeigt werden, dass die plazentale alkalische Phosphatase (PLAP), ein GPI-verankertes Protein, welches vermutlich in Rafts lokalisiert ist, nach Extraktion aus Liposomen bei 4°C nur Triton-X-100-unlöslich war, wenn dieses sich in einer Lipidumgebung befand, in der die Lipide überwiegend gesättigte Fettsäuren trugen (33% Sphingolipide und 33% Cholesterin). Hingegen war das raft-assoziierte Protein Triton-X-100-löslich, wenn der Sphingolipid-Anteil auf 10% gesenkt wurde, in dem man z. B. Cholesterin mit Hilfe von Cyclodextrin entfernt hat (Schroeder et al., 1998). Allerdings wurde in den vergangenen Jahren auch dieses Verfahren kontrovers diskutiert, da durch das Einwirken des Detergenz auf die Zellen möglicherweise bestimmte Lipide, wie z.B. Phospholipide, solubilisiert werden könnten, wohingegen andere wie Glykosphingolipide und Cholesterin unlöslich zurückbleiben und die Rafts-Fraktion bilden. Ein Beweis für die Existenz dieser Mikrodomänen in vivo konnte mit dieser Methode bislang nicht hinreichend geführt werden. Allerdings konnten mittlerweile auch durch andere unabhängige Methoden vermehrt Hinweise auf die Richtigkeit der von Brown und Rose erhaltenen Ergebnisse gefunden werden.

Dass hierbei u.U. auch Artefakte durch die Anwendung solcher Verfahren entstehen können, soll die Abbildung 1.3 verdeutlichen. In der rechten unteren Grafik wird eine mögliche Quervernetzung mehrerer Mikrodomänen miteinander durch die Anbindung von bifunktionellen Antikörpern bzw. chemischen Substraten gezeigt.

Als eine Möglichkeit zur Isolation von „rafts“ aus Zellen wird die Detergenz-unterstützte Lyse bei 4°C mit anschließender Ultrazentrifugation angewendet. Dieses von Brown und Rose (1992) entwickelte Verfahren basiert auf der Verwendung eines Lysis-Puffers, welcher bis zu 1 % Triton-X-100 enthält. Dabei werden Mikrosomen und liposomale Körperchen von den in den Mikrodomänen enthaltenen Lipiden und Proteinen ausgebildet, die in 40 %-iger Saccharose eine niedrige Dichte besitzen und somit im Dichtegra-

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dienten in obere Bereiche des Zentrifugenröhrchens „schweben“ (Übersicht in London und Brown, 2000).

Es konnte nachgewiesen werden, dass bei 37°C keine „schwimmende Fraktion“ mehr erhalten wird, so dass man davon ausgehen kann, dass hierbei die Zelllyse vollständig war und Mikrodomänen bzw. Liposomenbildung durch die Detergenzwirkung aufgelöst bzw. verhindert wurden. So konnte weiterhin gezeigt werden, dass die plazentale alkalische Phosphatase (PLAP), ein GPI-verankertes Protein, welches vermutlich in „rafts“ lokalisiert ist, nach Extraktion aus Liposomen bei 4°C nur Triton X-100-unlöslich war, wenn dieses sich in einer Lipidumgebung befand, in der die Lipide überwiegend gesättigte Fettsäuren trugen (33 % Sphingolipide und 33 % Cholesterol). Hingegen war das Protein Triton X-100-löslich, wenn der Sphingolipid-Anteil auf 10 % gesenkt wurde (Schroeder et al., 1998).

Allerdings wurde in den vergangenen Jahren auch dieses Verfahren kontrovers diskutiert, da durch das Einwirken des Detergenz auf die Zellen möglicherweise bestimmte Lipide, wie z.B. Phospholipide, solubilisiert werden könnten, wohingegen andere wie Glykosphingolipide und Cholesterol unlöslich zurückbleiben und die „rafts“-Fraktion bilden. Ein Beweis für die Existenz dieser Mikrodomänen in vivo konnte mit dieser Methode bislang nicht hinreichend geführt werden. Allerdings konnten mittlerweile auch durch andere unabhängige Methoden vermehrt Hinweise auf die Richtigkeit der von Brown und Rose erhaltenen Ergebnisse gefunden werden.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02) Singulus

[9.] Msf/Fragment 038 08 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-08-22 13:42:25 Hindemith
Fragment, Hoernschemeyer 2001, KeineWertung, Msf, SMWFragment, Schutzlevel, ZuSichten

Typus
KeineWertung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 38, Zeilen: 8 ff.
Quelle: Hoernschemeyer 2001
Seite(n): 119, 120, Zeilen: 119: 21ff; 120: 1ff
Diese Versuche wurden in Anlehnung an die Veröffentlichungen von Brown und Rose (1992) durchgeführt. Die Zellen wurden in 21 cm² ∅ Kulturschalen zur Konfluenz herangezogen. Anschließend wurden sie 1x mit eiskaltem PBS gewaschen und mit 2-3 ml TNE-Puffer (pH 7,4), der Proteaseinhibitoren (1 mM PMSF und ein Cocktail von Proteaseinhibitoren, Complete) und 1% Triton-X-100 enthielt, lysiert. Die Zellreste wurden mit einem Zellschaber von den Schalenböden geschabt und mittels eines (Hand)-Homogenisators und durch 20-maliges Pressen durch eine Nadel (22 gauge) homogenisiert. Anschließend 30 min auf Eis inkubiert.

Die erhaltene Suspension wurde anschließend mit 60%-Optiprep-Lösung in TNE-Puffer auf 40% Optiprep-Lösung eingestellt und auf den Boden eines Zentrifugenröhrchens pipettiert. Dann wurde sie mit 2,1 ml 30%- und 0,9 ml 5%-Optiprep-Lösung in TNE-Puffer überschichtet und in der Ultrazentrifuge (L8-M, Beckman, Rotor 50.2 Ti) 4h bei 4°C, 40.000 rpm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation werden je 7 Fraktionen von ca. je 600 μl Volumen gesammelt. Von diesem Extrakten wurden Aliquots für eine Proteinbestimmung nach der BCA-Methode (s. 2.9.4) abgenommen, die restlichen Proben wurden bis zur weiteren Aufarbeitung bei -80°C eingefroren.

wurden in Anlehnung an die Veröffentlichungen von Brown und Rose

(1992) und Melkonian et al. (1999) durchgeführt. Die Zellen wurden in 21 cm² Kulturschalen zur Konfluenz herangezogen, und nach 5.2.3.2 mit den jeweiligen Sphingolipid/BSA-Komplexen inkubiert. Die Zellen wurden ohne Belichtung mit 1 ml TNEPuffer pH 7,5, der 1 % Triton-X-100 enthielt, lysiert. Die Zellreste wurden mit einem Zellschaber von den Schalenböden geschabt und entweder mittels eines (Hand)-Homogenisators oder durch 40-maliges Pressen durch eine Nadel (22 gauge) homogenisiert. Die erhaltene Suspension wurde anschließend mit 80 %-Saccharose-Lösung in TNEPuffer auf 40 % Saccharose eingestellt und auf den Boden eines Zentrifugenröhrchens pipettiert. Dann wurde mit 5 ml 38 %- und 3 ml 5 %-Saccharose-Lösung in TNE-Puffer überschichtet und in der Ultrazentrifuge (L8-80M, Beckman, München) im Schwenkrotor SW41Ti 18 h bei 4°C zentrifugiert (28000 rpm, 135000·g). Das Zentrifugenröhrchen wurde vorsichtig im Boden angestochen und der Inhalt in Fraktionen von ca. 300 μl Volumen

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gesammelt. Die Lipide wurden über RP-18-Material von polaren und wasserlöslichen Komponenten (u.a. Saccharose) befreit (5.2.3.7). Anschließend wurde die enthaltene Radioaktivität im Szintillationszähler quantifiziert (5.2.1.2) und der Lipidextrakt über Dünnschichtchromatographie aufgetrennt.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), (Hindemith)

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