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Quelle:Msf/Wagner 2004

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Angaben zur Quelle [Bearbeiten]

Autor     Bettina Wagner
Titel    Experimentelle Untersuchungen zum retroviralen Gentransfer in primäre

Chondrozyten des Kaninchens: Entwicklung konstitutiver und Tetrazyklininduzierbarer Expressionssysteme

Ort    München
Jahr    2004
URL    http://edoc.ub.uni-muenchen.de/1907/1/Wagner_Bettina.pdf

Literaturverz.   

nein
Fußnoten    nein
Fragmente    8


Fragmente der Quelle:
[1.] Msf/Fragment 036 17 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-06-27 14:45:24 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Wagner 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 36, Zeilen: 17-25
Quelle: Wagner 2004
Seite(n): 47, Zeilen: 1 ff.
2.6.4.5 Bestimmung der Zellzahl

Die Zellen wurden trypsiniert und in komplementiertem Medium aufgenommen. Zur Bestimmung der Lebendzellzahl wurde die Trypanblau-Bestimmung verwendet. 100 μl Trypanblau wurden mit 100 μl Zellsuspension gemischt und 5 bis 10 min inkubiert. Lebende Zellen nehmen den Farbstoff nicht auf, sie erschienen weiß und transparent, während durch die nicht mehr intakte Zellmembran toter Zellen der Farbstoff eindringen kann und diese dann unter dem Mikroskop blau gefärbt erscheinen läßt. Eine Neubauer-Zählkammer wurde mit dem Farbstoff-Zellgemisch befüllt. Zwei der jeweils gegenüberliegenden Eckquadrate, bestehend aus je 16 Kleinquadraten wurden unter dem Mikroskop [(Konfokales Laser Scanning Mikroskop, Olympus) ausgezählt, wobei nur nicht angefärbte Zellen berücksichtigt wurden.]

3.3.2.4 Zellzählung mit dem Hämocytometer nach Neubauer

Die Zellen wurden trypsiniert und in komplementiertem Medium aufgenommen. 100 μl Trypanblau (Fa. Biochrom, Berlin) wurden mit 100 μl Zellsuspension gemischt und 5 bis 10 min inkubiert. Lebende Zellen nehmen den Farbstoff nicht auf, während durch die nicht mehr intakte Zellmembran toter Zellen der Farbstoff eindringen kann und diese dann unter dem Mikroskop blau gefärbt erscheinen. Eine Kammer eines Hämocytometers wurde mit dem Farbstoff-Zellgemisch befüllt. Zwei der jeweils gegenüberliegenden Eckquadrate, bestehend aus je 16 Kleinquadraten wurden unter dem Mikroskop (Axiovert 25, Fa. Zeiss, Jena) ausgezählt, wobei nur nicht angefärbte Zellen berücksichtigt wurden.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[2.] Msf/Fragment 037 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-06-28 17:38:22 Schumann
Fragment, Gesichtet, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Wagner 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 37, Zeilen: 1-6
Quelle: Wagner 2004
Seite(n): 47, Zeilen: 7 ff.
[Zwei der jeweils gegenüberliegenden Eckquadrate, bestehend aus je 16 Kleinquadraten wurden unter dem Mikroskop] (Konfokales Laser Scanning Mikroskop, Olympus) ausgezählt, wobei nur nicht angefärbte Zellen berücksichtigt wurden.

Bestimmung der Zellzahl: Ein Eckquadrat der Kammer hat eine Fläche von 10-4 cm2 und eine Höhe von 10μm. Die Zellsuspension ist 1:2 verdünnt wobei zwei Eckquadrate gezählt wurden. Daraus ergibt folgende Formel [sic]:

Anzahl gezählter Zellen x 104 = Zellzahl/ml Zellsuspension.

Zwei der jeweils gegenüberliegenden Eckquadrate, bestehend aus je 16 Kleinquadraten wurden unter dem Mikroskop (Axiovert 25, Fa. Zeiss, Jena) ausgezählt, wobei nur nicht angefärbte Zellen berücksichtigt wurden.

Bestimmung der Zellzahl: Ein Eckquadrat der Kammer hat eine Fläche von 10-4 cm2 und eine Höhe von 10 μm. Die Zellsuspension ist 1:2 verdünnt wobei zwei Eckquadrate gezählt wurden. Daraus ergibt folgende Formel [sic]:

Anzahl gezählter Zellen x 104 = Zellzahl/ml Zellsuspension.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Übereinstimmung bis in die fehlenden Wörter ("Daraus ergibt folgende Formel.").

Auch ist die übernommene Formel wohl fehlerhaft, da 10-4 cm2 x 10μm = 10-4 mm3 = 10-4 μl , und daher die Formel folgendermaßen lauten müsste:

Anzahl gezählter Zellen x 104 = Zellzahl/μl Zellsuspension.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[3.] Msf/Fragment 042 10 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-04 21:19:37 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Wagner 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 42, Zeilen: 10-20
Quelle: Wagner 2004
Seite(n): 47 f., Zeilen: 47: 25 ff.; 48: 1 ff.
In pRVH-1 wurde die U3 Region der 5’LTR durch den humanen intermediate early Cytomegalievirus Promotor (CMV IE Promotor) ersetzt. Die 3’LTR entspricht der wildtyp Mo-MLV LTR. Dieser Aufbau hat zur Folge, dass die Genexpression nach Transfektion in eukaryotischen Zellen vom CMV IE Promotor betrieben wird. Bei viraler Transduktion wird in Folge der reversen Transkription und Integration dieser Promotor durch die retrovirale U3 Region ersetzt, welche Promotor- und Enhancersequenzen enthält. Die so gebildete vollständige LTR steuert dann die Genexpression. Für die Verpackung der viralen mRNS ist das erweiterte Verpackungssignal ψ+ enthalten, welche den 5’-nicht-translatierten Anteil des gag Gens enthält und eine bessere Verpackung ermöglicht (Bender et al., 1987). In pBullet wurde die U3 Region der 5’LTR durch den humanen intermediate early Cytomegalievirus Promotor (CMV IE Promotor) ersetzt. Die 3’LTR ist unverändert und entspricht der wildtyp Mo-MLV LTR (siehe auch Abbildung 8 A). Dieser Aufbau hat zur Folge, dass die Genexpression nach Transfektion in eukaryotischen Zellen vom CMV IE Promotor betrieben wird. Bei viraler Transduktion wird in Folge der reversen Transkription und Integration dieser Promotor durch

[Seite 48:]

die retrovirale U3 Region ersetzt, welche Promotor- und Enhancersequenzen enthält. Die so gebildete vollständige LTR steuert dann die Genexpression. Für die Verpackung der viralen mRNA ist das erweiterte Verpackungssignal 􀀀 + enthalten, welche den 5’-nicht-translatierten Anteil des gag Gens enthält und eine bessere Verpackung ermöglicht (BENDER et al., 1987).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[4.] Msf/Fragment 043 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-04 21:26:52 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Wagner 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 43, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Wagner 2004
Seite(n): 22, 48, 51, 52, Zeilen: 22: 24ff; 48: 5ff; 51: 9ff; 52: 1
Der Vektor enthält einen Spleißdonor und -akzeptor, die denen des wildtyp Mo-MLV entsprechen und hier für die Synthese der env-mRNA notwendig sind. Der Vektors pRVH-1 enthält zusätzliche Schnittstellen in Form einer multiple cloning site. Für die Insertion des Caveolin-1shRNAi muss die EcoRI und XhoI Schnittstelle verwendet werden, um einen ordnungsgemäßen Spleißvorgang zu gewährleisten. Die Verwendung einer internal ribosomal entry site-Sequenz (IRES) ist für die Expression verschiedener Proteine von einer mRNA notwendig. PRVH-1 wurde für die Kombination mit den Verpackungsplasmiden pVSV.G entwickelt, um mittels transienter Transfektion in Phoenix Zellen innerhalb von nur einer Woche retrovirale Zellüberstände mit hohem viralem Titer zu generieren. Das Verpackungsplasmid ist in Abbildung 14 schematisch dargestellt. Der in allen Plasmiden enthaltende humane CMV IE Promotor und das im bakteriellen Plasmidanteil enthaltende SV 40 ori bewirken eine stärkere Plasmidexpression und damit höhere virale Titer.

Bei der Verwendung der Zelllinie 293T bewirken die Proteine der adenoviralen E1A Region eine Aktivierung des CMV IE Promotors. Das in den Zellen enthaltende SV 40 large T Antigen ermöglicht durch Wirkung auf das SV 40 ori der Plasmide eine Amplifikation der kompletten Plasmide und erhöht die Plasmidkopienzahl pro Zelle. Das G-Protein des Vesikulären-Stomatitis-Virus (VSV.G), einem Rhabdovirus, kodiert für die Hüllproteine des Vesikulären- Stomatitis-Virus und enthält ebenfalls den CMV IE Promotor für die Genexpression und das SV 40 ori. Im Gegensatz zu den anderen Hüllproteinen, findet bei VSV.G der Viruseintritt in die Zelle mittels Membranfusion nach Bindung an Phospholipidkomponenten der Zellmembran statt (Mastromarino et al., 1987). Da in diesem Fall die virale Infektion nicht von der Anwesenheit spezifischer Rezeptorproteine abhängig ist, besteht ein sehr großes Wirtsspektrum (Yee et al., 1994). VSV.G-pseudotypisierte Viren haben außerdem den Vorteil, dass sie im Gegensatz zu anderen Retroviren mittels Ultrazentrifugation konzentriert werden können (Burns et al., 1993).

2.8.2 Phoenix-Zellen: Verpackungszelllinie

Phoenix-Zellen sind eine Retrovirus-Verpackungszelllinie der dritten Generation für die Generierung amphotroper, MLV-abstammender Retroviren. Diese Zelllinie basiert auf 293T Zellen, welche mit zwei Hilfskonstrukten stabil transfiziert wurden. Die retroviralen Gene befinden sich auf zwei voneinander unabhängigen [Konstrukten, was die Bildung rekombinanter replikationskompetenter Viren durch homologe Rekombination erschwert („split packaging function“) (Markowitz et al., 1988).]

Das G-Protein des Vesikulären-Stomatitis-Virus (VSV.G), einem Rhabdovirus, kann ebenfalls die viralen env-Poteine ersetzen (EMI et al., 1991). Im Gegensatz zu den anderen Hüllproteinen, findet bei VSV.G der Viruseintritt in die Zelle mittels Membranfusion nach Bindung an Phospholipidkomponenten der Zellmembran statt (MASTROMARINO et al., 1987). Da in diesem Fall die virale Infektion nicht von der Anwesenheit spezifischer Rezeptorproteine abhängig ist, besteht ein sehr großes Wirtsspektrum (YEE et al., 1994). VSV.G-pseudotypisierte Viren haben außerdem den Vorteil, dass sie im Gegensatz zu anderen Retroviren mittels Ultrazentrifugation konzentriert werden können (BURNS et al., 1993).

[Seite 48:]

Der Vektor enthält einen Spleißdonor und –akzeptor, die denen des wildtyp Mo-MLV entsprechen und hier für die Synthese der env-mRNA notwendig sind. [...] Als Weiterentwicklung des Vektors pSTITCH enthält pBullet zusätzliche Schnittstellen im Anschluss an die NcoI Schnittstelle in Form einer multiple cloning site. Für die Insertion eines Transgens muss jedoch immer auch die NcoI Schnittstelle verwendet werden, um einen ordnungsgemäßen Spleißvorgang zu gewährleisten.

pSTITCH, bzw. pBullet, wurde für die Kombination mit den Verpackungsplasmiden pHIT 60 (SONEOKA et al., 1995, vgl. Abbildung 9 B) und pCOLT-GALV (WEIJTENS et al., 1998, vgl. Abbildung 9 D) entwickelt, um mittels transienter Transfektion in 293T Zellen innerhalb von nur einer Woche retrovirale Zellüberstände mit hohem viralen Titer zu generieren. Die beiden Verpackungsplasmide sind in Abbildung 9 schematisch dargestellt. Der in allen Plasmiden enthaltende humane CMV IE Promotor und das im bakteriellen Plasmidanteil enthaltende SV 40 ori bewirken eine stärkere Plasmidexpression und damit höhere virale Titer. Bei der Verwendung der Zelllinie 293T bewirken die Proteine der adenoviralen E1A Region eine Aktivierung des CMV IE Promotors. Das in den Zellen enthaltende SV 40 large T Antigen ermöglicht durch Wirkung auf das SV 40 ori der Plasmide eine Amplifikation der kompletten Plasmide und erhöht die Plasmidkopienzahl pro Zelle. [...] Das Plasmid pHCMV-G kodiert für die Hüllproteine des Vesikulären- Stomatitis-Virus und enthält ebenfalls den CMV IE Promotor für die Genexpression und das SV 40 ori.

[Seite 51:]

3.4.6 Phoenix-Ampho: Verpackungszelllinie der dritten Generation

Phoenix-Ampho Zellen sind eine Retrovirus-Verpackungszelllinie der dritten Generation für die Generierung amphotroper, MLV-abstammender Retroviren. Diese Zelllinie basiert auf 293T Zellen, welche mit zwei Hilfskonstrukten stabil transfiziert wurden. Die retroviralen Gene befinden sich auf zwei voneinander unabhängigen Konstrukten, was die Bildung rekombinanter replikationskompetenter Viren durch homologe Rekombination erschwert

[Seite 52:]

(„split packaging function“, eingeführt durch MARKOWITZ et al., 1988).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[5.] Msf/Fragment 044 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-04 21:48:45 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Wagner 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 44, Zeilen: 1-22
Quelle: Wagner 2004
Seite(n): 18, 48, 49, 51, 52, Zeilen: 18: 9ff; 48: letzte 3 Zeilen; 49: 1ff, 51: 12ff; 52: 1ff
[Die retroviralen Gene befinden sich auf zwei voneinander unabhängigen] Konstrukten, was die Bildung rekombinanter replikationskompetenter Viren durch homologe Rekombination erschwert („split packaging function“) (Markowitz et al., 1988). Ein Hilfskonstrukt enthält die Information für die Gene gag und pol, während die vom env Gen kodierten Hüllproteine auf dem VSV.G-Plasmid liegen. Damit diese Zellen virale Partikel bilden können, muss noch die genetische Information für die virale mRNS in die Zellen eingebracht werden, die dann durch die Genprodukte der vorhandenen Hilfskonstrukte zu einem infektionsfähigen Retrovirus verpackt wird. In der vorliegenden Arbeit erfolgte dieser Schritt durch Lipofectamine Transfektion.

2.8.2.1 Die Generierung transienter Retrovirus-Produzentenzellen mittels Transfektion

Transfektion bezeichnet das Einbringen von DNS in eukaryotische Zellen mit nicht-viralen Methoden. Eine Transfektion ist zunächst einmal nur transient, d. h. die DNS wird nicht in das Genom integriert, sondern verbleibt extrachromosomal. Ohne eine weitere Selektion geht solche DNS mit der Zeit verloren und die Transgenexpression kommt zum Erliegen. Zum Einbringen von Fremd-DNS in eukaryotische Zellen, die in der Zellkultur gehalten werden, existieren unterschiedliche Methoden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Transfektion mit Lipofectamin 2000® durchgeführt, das als polykationisches Lipid mit der negativ geladenen DNS einen Komplex bildet.

Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Protokoll für eine transiente Transfektion ist in Tabelle 8 aufgeführt.

[Seite 18:]

Ein Hilfskonstrukt enthält die Information für die Gene gag und pol, während die vom env Gen kodierten Hüllproteine auf einem anderen liegen.

[Seite 48:]

3.4.2 Die Generierung transienter Retrovirus-Produzentenzellen mittels Transfektion Transfektion bezeichnet das Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen mit nicht-viralen Methoden. Eine Transfektion ist zunächst einmal nur transient, d. h. die DNA wird nicht in

[Seite 49:]

das Genom integriert, sondern verbleibt extrachromosomal. Ohne eine weitere Selektion geht solche DNA mit der Zeit verloren und die Transgenexpression kommt zum Erliegen.

Zum Einbringen von Fremd-DNA in eukaryotische Zellen, die in der Zellkultur gehalten werden, existieren unterschiedliche Methoden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Calzium- Phosphat vermittelte Transfektion angewendet (WIGLER et al., 1977).

[...] Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Protokoll für eine transiente Transfektion für die Retrovirusproduktion ist in Tabelle 5 aufgeführt.

[Seite 51:]

Die retroviralen Gene befinden sich auf zwei voneinander unabhängigen Konstrukten, was die Bildung rekombinanter replikationskompetenter Viren durch homologe Rekombination erschwert

[Seite 52:]

(„split packaging function“, eingeführt durch MARKOWITZ et al., 1988). [...]

Damit diese Zellen virale Partikel bilden können, muss noch die genetische Information für die virale mRNA in die Zellen eingebracht werden, die dann durch die Genprodukte der vorhandenen Hilfskonstrukte zu einem infektionsfähigen Retrovirus verpackt wird. In der vorliegenden Arbeit erfolgte dieser Schritt durch retrovirale Transduktion.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[6.] Msf/Fragment 045 02 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-04 22:44:23 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Wagner 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 45, Zeilen: 1-26
Quelle: Wagner 2004
Seite(n): 4, 5, 49, 50, 51, 52, Zeilen: 4: 25ff; 5: 1ff; 49: 15ff; 50: 1ff; 51: 1ff; 52: 9ff
Tabelle 8:Transfektionsschema

Wenn alle zwei Plasmide in ein und dieselbe 293T Zelle transfiziert werden, werden hier alle viralen Proteine exprimiert, durch welche die ungespleißte mRNS des retroviralen Vektors als virale mRNS verpackt wird. Auf diese Weise werden infektiöse virale Partikel gebildet, die in den Zellüberstand abgegeben werden.

2.8.2.2 Die Gewinnung retroviraler Überstände

Für die weitere Verwendung wurden die retroviralen Überstände zunächst bei 300g für 5 min zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45μm filtriert. Hierdurch werden virusproduzierende Zellen und Zellreste entfernt. Das Filtrat wurde direkt für eine Transduktion verwendet oder kryokonserviert.

2.8.2.3 Kryokonservierung viraler Überstände

Für die Verwendung zu einem späteren Zeitpunkt wurden die filtrierten retrovirale Überstände erst in N2 eingefroren, dann bei -80°C kryokonserviert. Für eine spätere Transduktion wurde der benötigte Überstand in einem 22°C Wasserbad aufgetaut und sofort verwendet.

2.8.2.4 Retrovirale Transduktion

Im Gegensatz zur Transfektion werden bei einer Transduktion Zellen durch eine virale Infektion genetisch verändert. Hierbei wird die Eigenschaft von Retroviren genutzt, nach einer Infektion direkt stabil in das zelluläre Genom zu integrieren. Das Einbringen genetischen Materials in Zellen mittels viraler Vektoren wird als Infektion oder auch Transduktion bezeichnet. Ein viraler Vektor besteht aus einem menschen- oder tierpathogenen Virus, das für die Übertragung eines heterologen (fremden) Gens verändert wurde. Neben der Einführung des zu transportierenden Gens stehen dabei Veränderungen, welche die Pathogenität des Virus betreffen, im Vordergrund. Beim viralen Gentransfer nutzt man die natürliche Infektionsmaschinerie der Viren aus, um die Gene effizient in eine Zelle zu [bringen.]

[Seite 4:]

Das Einbringen genetischen Materials in Zellen mittels viraler Vektoren wird als Infektion oder auch Transduktion bezeichnet. Ein viraler Vektor besteht aus einem menschen- oder tierpathogenen Virus, das für die Übertragung eines heterologen (fremden) Gens verändert wurde. Neben der Einführung des zu transportierenden Gens stehen dabei Veränderungen, welche die Pathogenität des Virus betreffen, im Vordergrund.

[Seite 5:]

Beim viralen Gentransfer nutzt man die natürliche Infektionsmaschinerie der Viren aus, um die Gene effizient in eine Zelle zu bringen.

[Seite 49:]

Wenn alle drei Plasmide in ein und dieselbe 293T Zelle transfiziert werden, werden hier alle viralen Proteine exprimiert, durch welche die ungespleißte mRNA des retroviralen Vektors als virale mRNA verpackt wird. Auf diese Weise werden infektiöse virale Partikel gebildet, die in den Zellüberstand abgegeben werden.

[Seite 50:]

3.4.3 Die Gewinnung retroviraler Überstände

Für die weitere Verwendung wurden die retroviralen Überstände zunächst durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 􀀀 m filtriert. Hierdurch werden virusproduzierende Zellen und Zellreste entfernt. Das Filtrat wurde direkt für eine Transduktion verwendet oder kryokonserviert.

[Seite 51:]

3.4.4 Kryokonservierung viraler Überstände

Für die Verwendung zu einem späteren Zeitpunkt wurden retrovirale Überstände bei –80 °C kryokonserviert. Die filtrierten Überstände wurden in bedarfsgerechten Volumina (0,6 ml, 1,2 ml, 1,8 ml) in Cryotubes (Fa. Nalge Nunc Int., Rochester, USA) aliquotiert und dann sofort bei –80 °C gelagert. Für eine spätere Transduktion wurde der benötigte Überstand in einem 22 °C Wasserbad aufgetaut und sofort verwendet.

[Seite 52:]

3.4.7 Die Generierung stabiler Retrovirus-Produzentenzellen mittels retroviraler Transduktion

Im Gegensatz zur Transfektion werden bei einer Transduktion Zellen durch eine virale Infektion genetisch verändert. Hierbei wird die Eigenschaft von Retroviren genutzt, nach einer Infektion direkt stabil in das zelluläre Genom zu integrieren.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[7.] Msf/Fragment 046 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-09-20 12:54:48 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Wagner 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 46, Zeilen: 1-4
Quelle: Wagner 2004
Seite(n): 5, 51, Zeilen: 5: 2ff; 51: 8ff
Da Virusreplikation nur in tierischen- bzw. menschlichen Zellen möglich ist, findet die Generierung viraler Vektoren durch Zellkulturverfahren statt.

Das Protokoll für die retrovirale Transduktionen ist in der Tabelle 9 wiedergegeben.

[Seite 5:]

Da Virusreplikation nur in tierischen- bzw. menschlichen Zellen möglich ist, findet die Generierung viraler Vektoren durch Zellkulturverfahren statt.

[Seite 51:]

Das Protokoll für retrovirale Transduktionen ist in der Tabelle 6 wiedergegeben.

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle. Identisch bis zum falschen Bindestrich nach "tierischen".

Die Übernahme von der Vorseite setzt sich hier fort.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[8.] Msf/Fragment 099 17 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-04 22:56:39 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Wagner 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 99, Zeilen: 17-33
Quelle: Wagner 2004
Seite(n): 70 f., Zeilen: 70: letzte Zeile; 71: 1 ff.; 72: 4 ff.
Um die Transduktionseffizienz zu verbessern, wurden VSV.G-pseudotypisierte retrovirale Partikel generiert. Während die Infektion von Retroviren mit amphotropen Wirtsspektrum durch die Bindung an einen spezifischen zellulären Rezeptor (Ram 1) eingeleitet wird, interagiert VSV.G mit weit verbreiteten Phospholipid-Komponenten der Zellmembran. VSV.G-pseudotypisierte Viren zeigen daher ein breites Spektrum infizierbarer Zelltypen, darunter auch solche, die sich mit den herkömmlichen retroviralen Vektoren nicht oder nur schwer transduzieren lassen (Emi et al., 1991). Es ist daher anzunehmen, dass derart umhüllte Viren auch in der Lage sind humane primäre Keratinozyten zu transduzieren, obwohl eine derartige Anwendung bisher nicht beschrieben wurde. Da die langanhaltende Expression des VSV.G Proteins toxisch für Zellen ist, wurden diese Viren mittels transienter Transfektion von 293T Zellen produziert. Verwendet wurde das retrovirale Plasmid pRVH-1. Es wurden primäre Keratinozyten und HaCat-Zellen transduziert. Die Transduktionseffizienz lag bei etwa 80%. Hierfür wurden zuvor eingefrorene virale Überstände von zwei verschiedenen Transfektionen verwendet (Virusüberstand pRVH-1/VSV.G und Cav.1pRVH-1/VSV.G). Um die Transduktionseffizienz zu verbessern, wurden VSV.G-pseudotypisierte retrovirale

[Seite 71:]

Partikel generiert. Während die Infektion von Retroviren mit amphotropen Wirtsspektrum durch die Bindung an einen spezifischen zellulären Rezeptor (Ram 1) eingeleitet wird, interagiert VSV.G mit weit verbreiteten Phospholipid-Komponenten der Zellmembran. VSV.G-pseudotypisierte Viren zeigen daher ein breites Spektrum infizierbarer Zelltypen (ARAI et al., 1999; LEE et al., 2001), darunter auch solche, die sich mit den herkömmlichen retroviralen Vektoren nicht oder nur schwer transduzieren lassen (EMI et al., 1991). Es ist daher anzunehmen, dass derart umhüllte Viren auch in der Lage sind, Chondrozyten des Kaninchen zu transduzieren, obwohl eine derartige Anwendung bisher nicht beschrieben wurde. Da die langanhaltende Expression des VSV.G Proteins toxisch für Zellen ist, wurden diese Viren mittels transienter Transfektion von 293T Zellen produziert. Verwendet wurde das retrovirale Plasmid pBulletLZ.

[Seite 72:]

Hierfür wurden zuvor eingefrorene virale Überstände von zwei verschiedenen Transfektionen verwendet (Virusüberstand pBulletLZ/VSV.G (2803) und pBulletLZ/VSV.G (2507)).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

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