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Quelle:Msf/Wuestholz 2004

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Angaben zur Quelle [Bearbeiten]

Autor     Annette Wüstholz
Titel    Darstellung von Ceramid-induzierten Effekten durch reverse Translokation einer fluoreszierenden Proteinkinase
Ort    Heidelberg
Jahr    2004
Anmerkung    Dissertation, Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg
URL    http://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/4828/1/Diss_AnnetteWuestholz.pdf

Literaturverz.   

nein
Fußnoten    nein
Fragmente    2


Fragmente der Quelle:
[1.] Msf/Fragment 039 03 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-05 13:35:17 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Wuestholz 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 39, Zeilen: 3-27
Quelle: Wuestholz 2004
Seite(n): 53, 54, Zeilen: 53: 25 ff.; 54: 1 ff.
Zur Trennung der Zelllysate in Membranfraktion wurde eine bereits veröffentlichte Methode mit einigen Modifikationen angewandt.

Sofort nach Inkubation der Zellen mit den entsprechenden Stimulantien wurden sie zweimal kurz mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit Hilfe eines Zellschabers vorsichtig vom Zellboden gelöst und in 80 μl Lysispuffer, dem zur Proteaseinhibition ein Mix aus Benzamidin, Leupeptin, Thrypsin Inhibitor [je 10 μg/ml], Dithiothreitol (DTT) [10mM] und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) [1mM] frisch zugesetzt wird, resuspendiert. Dieser und alle folgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die Zellen wurden für zwei sek sonifiziert (10% Power) und 10 min auf Eis inkubiert. Nach der Ultrazentrifugation (Optima TLX Ultrazentrifuge Beckman) bei 100.000g für 30 min und 4°C wurde der Zellüberstand abgenommen (Zytosolfraktion). Für die nachfolgende Protein-bestimmung (s. 2.9.5) wurde pro Probe ein Aliquot von je 10 μl separiert, bevor alle Proben bei -80°C gelagert wurden. Die Zellpellets wurden anschließend in 45 μl Lysispuffer vorsichtig resuspendiert und wieder bei 100.000g und 4°C für 30 min zentrifugiert. Dieser Zellüberstand wurde als so genannte Waschfraktion verworfen.

Die verbleibenden Zellpellets wurden in 55 μl Lysispuffer resuspendiert, der zusätzlich mit 0,2% Triton X-100 (v/v) versetzt werde, und für 15 sek. sonifiziert (10% Power). Nach der Inkubation auf Eis für 10 min wurden die Extrakte erneut bei 100.000g und 4°C für 30 min zentrifugiert. Die Überstände wurden abgenommen (Membranfraktion) und pro Probe wurde ein Aliquot von 10 μl für die Proteinbestimmung (s. 2.9.5) entnommen, bevor alle Proben bei -80°C eingefroren wurden.

Zur Trennung der Zelllysate in Zytosol- und Membranfraktion wird eine bereits veröffentlichte Methode mit einigen Modifikationen angewandt [145].

Sofort nach Inkubation der Zellen mit den entsprechenden Stimulantien werden sie zweimal kurz mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Zellen werden mit Hilfe eines Zellschabers vorsichtig

[Seite 54]

vom Zellboden gelöst und in 80 μl Lysepuffer, dem zur Proteaseinhibition ein Mix aus Benzamidin, Leupeptin, Thrypsin Inhibitor [je 10μg/ml], Dithiothreitol (DTT) [10mM] und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) [1mM] frisch zugesetzt wird, resuspendiert. Dieser und alle folgenden Schritte werden bei 4 °C durchgeführt. Die Zellen werden für zwei Sekunden sonifiziert (10% Power) und 10 min auf Eis inkubiert. Nach der Ultrazentrifugation (Beckman OptimaTM TL) bei 100000xg für 30 min und 4 °C wird der Zellüberstand abgenommen (Zytosolfraktion). Für die nachfolgende Proteinbestimmung wird pro Probe ein Aliquot von je 23 μl separiert, bevor alle Proben bei -80 °C gelagert werden. Die Zellpellets werden anschließend in 45 μl Lysepuffer vorsichtig resuspendiert und wieder bei 100000xg und 4 °C für 30 min zentrifugiert. Dieser Zellüberstand wird als so genannte Waschfraktion verworfen. Die verbleibenden Zellpellets werden in 55 μl Lysepuffer resuspendiert, der zusätzlich mit 0,2 % (V/V) Triton X-100 versetzt wird, und für 15 Sekunden sonifiziert (10% Power). Nach der Inkubation auf Eis für 10 min werden die Extrakte erneut bei 100000xg und 4 °C für 30 min zentrifugiert. Die Überstände werden abgenommen (Membranfraktion) und pro Probe wird ein Aliquot von 17 μl für die Proteinbestimmung entnommen, bevor alle Proben bei -80 °C eingefroren werden.


145. Hong, D. H., J. Huan, B. R. Ou, J. Y. Yeh, T. C. Saido, P. R. Cheeke, and N. E. Forsberg, Protein kinase C isoforms in muscle cells and their regulation by phorbol ester and calpain, 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1267 (1), 45-54

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[2.] Msf/Fragment 088 02 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-05 13:42:49 Hindemith
Fragment, Gesichtet, KeineWertung, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Wuestholz 2004

Typus
KeineWertung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 88, Zeilen: 2-10
Quelle: Wuestholz 2004
Seite(n): 24, Zeilen: 1ff
HaCat-Zellen wurden in Petrischalen (Ø 35mm) ausgesät und nach der Inkubation mit C2-Ceramid zur Gewinnung der Zelllysate in Lysispuffer resuspendiert. Die Proteine wurden in gleichen Proteinmengen zur elektrophoretischen Trennung auf ein SDS/Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Nach Inkubation der Membranen mit Primärantikörper gegen p-Caveolin-1 (Y14) und entsprechendem Sekundärantikörper konnte nach Visualisierung der spezifischen Banden mit der ECL-Methode ein deutlicher Intensitätsunterschied nach 20 Minuten zwischen der Kontrolle und den mit C2-Ceramid behandelten Lysaten festgestellt werden (Abbildung 33C). Zur Bestimmung der Zellverteilung der PKC-α auf Proteinebene mittels Western Blot wurden HepG22aI Zellen in Petrischalen (Ø 35mm) ausgesät und nach der Inkubation mit C6- Ceramid zur Gewinnung der Zelllysate in Lysepuffer resuspendiert. Nach Fraktionierung der Lysate in Zytosol- und Membranextrakt mittels Ultrazentrifugation wurden die Proteine in gleichen Proteinmengen zur elektrophoretischen Trennung auf ein SDS/Polyacrylamid-Gel aufgetragen, um sie auf eine PVDF Membran zu blotten. Nach Inkubation der Membranen mit Primärantikörper gegen PKC-α und entsprechendem Sekundärantikörper konnte nach Visualisierung der spezifischen Banden mit der ECL-Methode kein Intensitätsunterschied zwischen der Kontrolle und den mit C6-Ceramid behandelten Lysaten festgestellt werden (Abb. 12).
Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

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