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Quelle:Raw/Müller 2001

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Angaben zur Quelle [Bearbeiten]

Autor     Hans-Joachim Müller
Titel    PCR - Polymerase-Kettenreaktion
Verlag    Spektrum Akademischer Verlag
Datum    13. September 2001
Seiten    134
ISBN    978-3827410580
URL    http://www.amazon.de/PCR-Polymerase-Kettenreaktion-Hans-Joachim-M%C3%BCller/dp/3827410584/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1346860688&sr=8-1

Literaturverz.   

ja
Fußnoten    ja
Fragmente    5


Fragmente der Quelle:
[1.] Raw/Fragment 066 25 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2012-09-05 20:35:03 Fret
Fragment, Gesichtet, Müller 2001, Raw, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 66, Zeilen: 25-45
Quelle: Müller 2001
Seite(n): 1, Zeilen: 16-35
4.5. Polymerasekettenreaktion

Das Prinzip der Polymerasekettenreaktion basiert auf der Denaturierung der doppelsträngigen DNA. Dabei entstehen zwei einzelne Stränge, an deren jeweiligen 5`- und 3`-Ende ein zu amplifizierender Bereich entsteht, an den sich spezifische Oligonucleotidmoleküle (Primer) anlagern können (Annealing).

Die Oligonucleotide werden von einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynucleosid-Triphosphate verlängert (elongiert).

Die DNA-Polymerase verlängert den entsprechenden DNA-Doppelstrang so lange, bis die Reaktion unterbrochen wird. Der Abbruch erfolgt in der Regel durch die Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 95 °C, die wiederum verbunden ist mit einer wiederholten Denaturierung der doppelsträngigen DNA.

Kühlt man den Ansatz in Anwesenheit freier Oligonucleotide auf 60-40 °C herunter, so binden sich diese in Abhängigkeit ihres mittleren Schmelzwertes an die komplementären Sequenzen der DNA-Matrize. Die Synthese eines weiteren Doppelstranges kann jetzt wiederholt werden.

Die Polymerasekettenreaktion bietet in Kombination mit einer thermostabilen DNA-Polymerase den Vorteil, dass alle Komponenten, wie z.B. Enzym, Matrize, Oligonucleotide, Desoxynucleosid-Triphosphate etc. in einem Reaktionsgefäß zusammengeführt und die DNA vollautomatisch in einem Thermocycler amplifiziert werden kann. Bei einer Durchführung von z. B. 25 PCR-Zyklen können aus einem Zielmolekül 3,2×107 Kopien hergestellt werden.

1.1 Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Das Prinzip der PCR lässt sich wie folgt beschreiben: Es basiert auf der Denaturierung einer doppelsträngigen DNA (dsDNA) (Abb. 1-1: A), an welche sich am 5`- und 3`-Ende des zu amplifizierenden Bereiches spezifische Oligonucleotidmoleküle anlagern (Annealing) (Abb. 1-1: B). Diese Oligonucleotide werden von einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynucleosid-Triphosphate (dNTPs) verlängert (elongiert) (Abb. 1-1: C). Die DNA-Polymerase elongiert den entstehenden DNA-Doppelstrang so lange, bis sie von der DNA ,abfällt` oder die Reaktion unterbrochen wird. Dieser Abbruch kann z.B. durch eine Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 95 °C verbunden mit einer wiederholten Denaturierung der dsDNA erfolgen. Kühlt man den Ansatz in Anwesenheit freier Oligonucleotide auf 60-40 °C herunter, so binden sich diese in Abhängigkeit ihres mittleren Schmelzwertes (Tm-Wertes) an die komplementären Sequenzen der DNA-Matrize (Abb. 1-1: D). Die Synthese eines weiteren Doppelstranges kann jetzt wiederholt werden (Abb. 1-1: E).

Die PCR bietet in Kombination mit einer thermostabilen DNA-Polymerase den Vorteil, dass alle Komponenten (Enzym, Matrize, Oligonucleotide, dNTPs, etc.) in einem Reaktionsgefäß zusammengeführt und die DNA vollautomatisch in einem Thermocycler amplifiziert werden kann. Die PCR-Effizienz bzw. Sensitivität dieses Systems zeigt sich schon bei der Durchführung von 25 PCR-Zyklen, da aus einem Zielmolekül bereits 3,2×107 Kopien synthetisiert werden.

Anmerkungen

Die Quelle der wörtlichen Übernahmen ist nicht angegeben.

Sichter
(Graf Isolan), fret

[2.] Raw/Fragment 067 02 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2012-09-05 20:37:23 Fret
Fragment, Gesichtet, Müller 2001, Raw, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 67, Zeilen: 2-4, 5-6, 8-10
Quelle: Müller 2001
Seite(n): 3, Zeilen: 18, 21-22, 23-26
DNA-Polymerasen: Hierfür wird die isolierte DNA-Polymerase aus dem thermostabilen Bakterienstamm Thermus-aquaticus eingesetzt. [...] Seitdem ist das Enzym als Taq-DNA-Polymerase bekannt und wird für ca. 90 Prozent aller PCRs herangezogen. [...] Dies ist ein großer Vorteil, da nicht nach jedem Denaturierungsschritt ein neues Enzym hinzugegeben werden muss. 1.2 DNA-Polymerasen

[...] Bei diesem mesophilen (optimale Aktivität bei 37 °C) Enzym musste nach jedem Denaturierungsschritt ein neues Enzym hinzugegeben werden. [...] Eingesetzt wurde hierfür die aus dem thermostabilen Bakterienstamm Thermus-aquaticus isolierte DNA-Polymerase (Saiki et al. 1988). Seither ist das Enzym als Taq-DNA-Polymerase bekannt und wird immer noch für ca. 90% aller PCRs herangezogen.

Anmerkungen

Die Quelle der wörtlichen Übernahmen ist nicht angegeben.

Sichter
(Graf Isolan), fret

[3.] Raw/Fragment 067 11 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2012-09-05 20:45:15 Fret
Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Müller 2001, Raw, SMWFragment, Schutzlevel sysop

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 67, Zeilen: 11-35
Quelle: Müller 2001
Seite(n): 4-5, Zeilen: S.4,1-5.8-15.17-18.27-31 und S.5,6-8
PCR-Puffer: Eine große Bedeutung für eine effektive PCR wird dem PCR-Puffer beigemessen. Mit dieser Lösung werden der Polymerase alle notwendigen chemischen Komponenten gegeben, um ein annähernd optimales Milieu für dass Enzym bei verschiedenen Temperaturen bereitzustellen. Alle Puffer weisen folgende Komponenten auf: Cl`Ionen [sic!], Mg2+-Ionen und dNTPs.

MgCl2 und MgSO4: Magnesiumchlorid ist ein metabolischer Cofaktor für die meisten DNA-Polymerasen. Ob MgCl2 oder MgSO4 eingesetzt wird, hängt von der DNA-Polymerase ab. MG2+-Ionen [sic!] beeinflussen die Enzymaktivität, erhöhen die Schmelztemperatur der doppelsträngigen DNA und bilden einen löslichen Komplex mit Nucleotiden, wodurch das Substrat gebildet wird, welches die Polymerase erkennt. Die MgCl2- bzw. MgSO4-Konzentration kann die Spezifität und Ausbeute der PCR erheblich beeinflussen.

Nucleotide: Desoxynucleosid-Triphosphate (dNTPs) sind die Substrate für die DNA-Polymerasen. Sie bilden einen Komplex mit den Mg2+-Ionen und werden in Abhängigkeit der Basenpaarungsregel von der Polymerase an das jeweilig freistehende 3`-Ende des zu synthetisierenden Stranges unter Abspaltung von Pyrophosphat und Wasser verknüpft. Die optimale Konzentration der dNTPs hängt von den Amplifikaten, den Oligonucleotiden, der Anzahl der PCR-Zyklen sowie von der Menge des MgCl2 ab.

[Seite 4]

1.3 PCR-Puffer:

Eine große Bedeutung für eine effektive PCR wird dem PCR-Puffer beigemessen. Mit dieser Lösung werden der Polymerase alle notwendigen chemischen Komponenten gegeben, um ein annähernd optimales Milieu für dass Enzym bei verschiedenen Temperaturen bereitzustellen. [...] aber alle Puffer weisen folgende Komponenten auf: Cl- Ionen, Mg2+ Ionen sowie dNTPs.

1.4 MgCl2 und MgSO4

Magnesiumchlorid ist ein metabolischer Cofaktor für die meisten DNA-Polymerasen. Ob MgCl2 oder MgSO4 eingesetzt wird, hängt von der DNA-Polymerase ab. Mg2+ Ionen beeinflussen die Enzymaktivität, erhöhen die Schmelztemperatur der dsDNA und bilden einen löslichen Komplex mit Nucleotiden, wodurch das Substrat gebildet wird, welches die Polymerase erkennt. [...] Die MgCl2- bzw. MgSO4-Konzentration kann die Spezifität und Ausbeute der PCR erheblich beeinflussen.

1.5 Nucleotide

Desoxynucleosid-Triphosphate (dNTPs) sind die Substrate für die DNA-Polymerasen. Sie bilden einen Komplex mit den Mg2+-Ionen und werden in Abhängigkeit der Basenpaarungsregel von der Polymerase an das jeweilig freistehende 3`-Ende des zu synthetisierenden Stranges unter Abspaltung von Pyrophosphat und Wasser verknüpft. [...]

[Seite 5]

Die optimale Konzentration der dNTPs hängt von den Amplifikaten, den Oligonucleotiden, der Anzahl der PCR-Zyklen sowie von der Menge des MgCl2 ab.

Anmerkungen

Die Quelle der wörtlichen Übernahmen ist nicht angegeben.

Sichter
(Graf Isolan), fret

[4.] Raw/Fragment 067 36 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2012-09-05 20:46:54 Fret
Fragment, Gesichtet, Müller 2001, Raw, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 67, Zeilen: 36-46
Quelle: Müller 2001
Seite(n): 6, Zeilen: 1-3, 5-8, 11-15
Oligonucleotide: Die Oligonucleotidmoleküle (Primer) werden in hohem Überschuss zum PCR-Ansatz gegeben. Es wird bei der Konstruktion der Primer darauf geachtet, dass das Basenpaarverhältnis G/C zu A/T annähernd gleich ist. Die Länge der Oligonucleotide sollte zwischen zwölf und maximal 50 Basen liegen. Die optimale Temperatur, welche eine spezifische Oligonucleotid-Anlagerung (Annealing) an die Ziel-DNA (Matrize) erlaubt, lässt sich aus dem berechneten Schmelzwert der Oligonucleotide errechnen. Der Schmelzwert wird in °C angegeben und sagt aus, bei welcher Temperatur 50 Prozent der Oligonucleotide gebunden sind. 1.8 Oligonucleotide

Die Oligonucleotidmoleküle (auch: Primer, Oligos, Oligonucleotide) werden in hohem Überschuss (0,2-2μM) zum PCR-Ansatz gegeben. [...] Es sollte bei der Konstruktion von Oligonucleotiden beachtet werden, dass das Basenpaarverhältnis G/C zu A/T annähernd gleich ist. Die Länge der Oligonucleotide sollte zwischen 12 und maximal 50 Basen liegen. [...] Die optimale Temperatur, welche eine spezifische Oligonucleotid-Anlagerung (Annealing) an die Ziel-DNA (Matrize) erlaubt, lässt sich aus dem berechneten Tm-Wert der Oligonucleotide errechnen. Der Tm-Wert wird in °C angegeben und sagt aus, bei welcher Temperatur 50 % der Oligonucleotide gebunden sind.

Anmerkungen

Die Quelle der wörtlichen Übernahmen ist nicht angegeben.

Sichter
(Graf Isolan), fret

[5.] Raw/Fragment 068 13 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2012-09-26 12:13:42 Hindemith
Fragment, KeineWertung, Müller 2001, Raw, SMWFragment, Schutzlevel, ZuSichten

Typus
KeineWertung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 68, Zeilen: 13-33
Quelle: Müller 2001
Seite(n): 2-3, Zeilen: S.2,1.4-8.11-12 und S.3,1-4
Denaturierung des DNA- Doppelstranges

Zu Beginn der PCR-Zyklen sollte ein ein- bis fünfminütiger Denaturierungsschritt bei 95 °C erfolgen. Währen [sic!] der Zyklen ist dann ein Denaturierungsschritt von einigen Sekunden ausreichend.

Annealing der Oligonucleotide

Die optimale Annealing-Temperatur muss für jedes Oligonucleotidpaar separat bestimmt werden. Bei zu hohen Temperaturen erfolgt kein Annealing und damit entsteht kein PCRProdukt. Bei zu niedrigen Temperaturen kommt es zu Fehlpaarungen und unspezifischen PCRProdukten.

Elongation der Oligonucleotide

Die Elongation erfolgt in der Regel bei 72 °C, dem Temperaturoptimum der Taq-DNA-Polymerase. Die Elongationszeit wird von der Länge der zu amplifizierenden DNA-Matrize sowie durch die Prozessivität der Polymerase bestimmt.

[Seite 2]

Denaturierung

[...] Zu Beginn der PCR-Zyklen sollte ein 1-5 minütiger Denaturierungsschritt bei 95 °C erfolgen. Während der Zyklen ist dann ein Denaturierungsschritt von einigen Sekunden ausreichend.

Oligonucleotid-Annealing

Die optimale Annealing-Temperatur muss für jedes Oligonucleotidpaar bestimmt werden (siehe Kap. 1.8). [...]

  • Zu hohe Temperatur: kein Annealing und damit entsteht kein PCR Produkt!
  • Zu niedrige Temperatur: Fehlpaarungen und damit unspezifische PCR Produkte!.

[Seite 3]

Oligonucleotid-Verlängerung (Elongation)

Die Elongation wird in der Regel bei 72 °C, dem Temperaturoptimum der Taq-DNA-Polymerase, durchgeführt. Die Elongationszeit wird von der Länge der zu amplifizierenden DNA-Matrize sowie durch die Prozessivität der Polymerase bestimmt.

Anmerkungen

Eine wörtlichen Übernahme ist nicht gekennzeichnet, die Quelle ist aber angegeben; die sich auf der Seite befindlichen Graphiken sind ebenfalls Müller (2001) entnommen.

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