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Quelle:Sw/Ruf 2007

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Angaben zur Quelle [Bearbeiten]

Autor     Sabine Ruf
Titel    Einfluss subchronischer Rauchbelastung auf die Entwicklung einer Myokardhypertrophie
Jahr    2007
Anmerkung    Dissertation Universität Gießen
URL    http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2007/4965/pdf/RufSabine-2007-07-06.pdf

Literaturverz.   

nein
Fußnoten    nein
Fragmente    2


Fragmente der Quelle:
[1.] Analyse:Sw/Fragment 045 03 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2013-01-16 22:40:57 Hindemith
Fragment, Ruf 2007, SMWFragment, Schutzlevel, Sw, Verschleierung, ZuSichten

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 45, Zeilen: 3-7, 14-24
Quelle: Ruf_2007
Seite(n): 40, 41, Zeilen: 40: 17ff; 41: 1ff
3.7.4.2.2. Real-time PCR-Ansatz

Um Pipettierfehler und Kontaminationsgefahren zu vermeiden und den Arbeitsaufwand gering zu halten wurde bei der real-time PCR ein Supermix der Firma Bio-Rad verwendet, welcher bereits alle wichtigen Ingredienzien in der richtigen Konzentration enthielt.

PCR-Reaktionsansatz/Probe:

iQ™ SYBR® Green Supermix 25 μl

fw-Primer 0,3 μl (100 μmol/l)

rev-Primer 0,3 μl (100 μmol/l)

aqua bidest. 6,4 μl

DNA-Template (1:10) 3 μl

Σ 20 μl/Probe

Es wurde für jede Probe eine Doppelbestimmung durchgeführt. Als Laufkontrolle galt der Ansatzmix ohne Template. Alle Arbeitsschritte erfolgten im Eisbad bei 0° bis 4°C.

3.7.4.2.3. PCR-Laufprogramme

Die DNA-Synthese erfolgte im Wesentlichen in drei Schritten. Jeder Zyklus bestand aus einem Denaturierungsschritt bei 95°C, um die beiden DNA-Stränge voneinander zu trennen, einem Hybridisierungsschritt, in dem die beiden Primer an den jeweils komplementären Strang binden und einem Syntheseschritt, während dessen der zwischen den Primern liegende DNA-Abschnitt mit Hilfe der DNA-Polymerase und der im Reaktionsmix vorhandenen Desoxyribonukleotide selektiv synthetisiert wurde. Während jedes PCR-Zyklus sollte sich demnach die Menge der spezifischen DNA [Abschnitte verdoppeln.]

Real time RT-PCR-Ansatz

Es wurde für die real time RT-PCR eine vorgefertigte Reaktionsmischung (Supermix®) der Firma Bio-Rad verwendet, um Pipettierfehler und Kontaminationsgefahren zu vermeiden und den Arbeitsaufwand gering zu halten. Dieser Supermix® enthielt bereits alle wichtigen Ingredienzien in den benötigten Konzentrationen. Es wurden die Primer, aqua bidest. und die verdünnte cDNALösung (DNA-Template) hinzugefügt.

[Seite 41]

PCR-Reaktionsansatz je Probe:

iQ™ SYBR® Green Supermix 10 μl

fw-Primer 0,3 μl (100 μmol/l)

rev-Primer 0,3 μl (100 μmol/l)

aqua bidest. 6,4 μl

DNA-Template (1:10) 3 μl

Σ = 20 μl/Probe

Es wurde für jede Probe eine Doppelbestimmung durchgeführt. Als Laufkontrolle galt der Reaktionsansatz ohne Template. Alle Arbeitsschritte erfolgten bei max. 4°C.

PCR-Laufprogramme

Die DNA-Synthese erfolgt in drei Schritten: Denaturierung, Hybridisierung (Annealing) und Synthese (Amplifikation). Jeder Zyklus besteht somit aus einem Denaturierungsschritt bei 95°C, in dem die beiden DNA-Stränge voneinander getrennt werden, einem Hybridisierungsschritt, in dem die beiden Primer an den jeweils komplementären Strang binden und einem Syntheseschritt, während dem der zwischen den Primern liegende DNA-Abschnitt mit Hilfe der DNA-Polymerase und der im Reaktionsmix vorhandenen Desoxyribonukleotide selektiv synthetisiert wird. In jedem PCR-Zyklus sollte sich demnach die Menge der spezifischen DNA-Abschnitte verdoppeln, [...]

Anmerkungen

Ein Quellenverweis fehlt. Die Probenzusammensetzung mag durchaus identisch sein, die beschreibenden Worte sollten es nicht sein, ohne dass die Quelle genannt ist. Man beachte auch, dass in der Quelle die Summe 20 μl/Probe korrekt ist, in der untersuchten Arbeit aber nicht.

Sichter
(Hindemith)

[2.] Analyse:Sw/Fragment 046 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2013-01-16 22:39:33 Hindemith
Fragment, Ruf 2007, SMWFragment, Schutzlevel, Sw, Verschleierung, ZuSichten

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 46, Zeilen: 1-4
Quelle: Ruf_2007
Seite(n): 41, 42, Zeilen: 41: 16ff; 42: 1ff
Theoretisch würde somit die Menge der Zielsequenz während der PCR-Reaktion exponentiell zunehmen. Es erfolgte eine Programmierung des iCyclers®, bei der die verschiedenen Schritte der PCR mit den unterschiedlichen Temperaturen festgelegt wurden.

Zyklus 1: (1x)

Step 1: 95ºC für 3,0 min

Zyklus 2: (45x)

Step 1: (Denaturierung) 95ºC für 30 sek

Step 2: (Annealing) 63ºC für 30 sek

Step 3: (Amplifikation) 72ºC für 30 sek

Zyklus 3: (100x)

Step 1: 50ºC für 10 sek

Nach Zyklus 2 Temperatursteigerung in 0,5°C-Schritten bis 100°C

In jedem PCR-Zyklus sollte sich demnach die Menge der spezifischen DNA-Abschnitte verdoppeln, und somit die DNA-Menge mit der gewünschten Zielsequenz während der PCR-Reaktion exponentiell zunehmen. Es erfolgte eine Programmierung des iCyclers®, bei der die verschiedenen Schritte der PCR mit den unterschiedlichen Temperaturen festgelegt wurden. [...]

[Seite 42]

Zyklus 1: (1x)

Step 1: 95ºC für 3 min

Zyklus 2: (45x)

Step 1: (Denaturierung) 95ºC für 30 sek

Step 2: (Annealing) x ºC für 30 sek

Step 3: (Amplifikation) 72ºC für 30 sek

Schmelzvorgang: Temperatursteigerung in 0,5°C-Schritten bis 100°C

Zyklus 3: (100x)

Step 1: 50ºC für 10 sek

Anmerkungen

Die Schritte mögen ja dieselben sein, deren Beschreibung sollte aber nicht ohne Quellenverweis übernommen sein.

Sichter
(Hindemith)

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