Fandom

VroniPlag Wiki

Quelle:Whs/Pinsdorf 2005

< Quelle:Whs

31.357Seiten in
diesem Wiki
Seite hinzufügen
Diskussion0

Störung durch Adblocker erkannt!


Wikia ist eine gebührenfreie Seite, die sich durch Werbung finanziert. Benutzer, die Adblocker einsetzen, haben eine modifizierte Ansicht der Seite.

Wikia ist nicht verfügbar, wenn du weitere Modifikationen in dem Adblocker-Programm gemacht hast. Wenn du sie entfernst, dann wird die Seite ohne Probleme geladen.

Angaben zur Quelle [Bearbeiten]

Autor     Ursula-Martina Pinsdorf
Titel    Der Einfluss von Raloxifen und Hormonersatztherapie auf Serummarker des Cholesterinmetabolismus bei postmenopausalen Frauen
Ort    Bonn
Jahr    2005
URL    http://hss.ulb.uni-bonn.de/2005/0629/0629.htm

Literaturverz.   

nein
Fußnoten    nein
Fragmente    13


Fragmente der Quelle:
[1.] Analyse:Whs/Fragment 005 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-02-09 22:23:32 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, Whs

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 5, Zeilen: 1 ff (komplett)
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 7, 9, Zeilen: 7: 1 ff.; 9: 1 ff.
1. EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG

1.1 Der Cholesterinstoffwechsel

1.1.1 Die Cholesterinbiosynthese und Sterinresorption

Wenige organische Moleküle haben ein so intensives und anhaltendes wissenschaftliches Interesse auf sich gelenkt wie das Cholesterin. Es ist das Paradebeispiel einer Janus-köpfigen Substanz, der Bösewicht, der einerseits Atherosklerose und vaskuläre Erkrankungen verursacht, andererseits aber auch für den Aufbau von Zellmembranen lebensnotwendig ist (Bloch, 1992). Im gesunden menschlichen Organismus stehen körpereigene Synthese, intestinale Aufnahme über die Nahrung, Veresterung durch spezifische Enzyme, extrazellulärer Transport mittels Lipoproteinen, und biliäre Ausscheidung des Cholesterins - in unveränderter oder in metabolisierter Form als Gallensäuren - miteinander im Gleichgewicht. Cholesterin ist ein sehr hydrophobes Molekül mit einer begrenzten Polarität aufgrund der β-ständigen Hydroxylgruppe am C3-Atom (Abbildung 1). Seine Hydrophobizität bestimmt wesentlich die Zellmembranfluidität, macht jedoch spezielle Mechanismen für seinen Transport in wässriger Umgebung notwendig.

Whs 05a diss.png

Abbildung 1 Strukturformel von Cholesterin (Cholest-5-en-3β-ol); die C-Atome sind systematisch durchnummeriert (Fieser und Fieser, 1961)

Häufig werden die absoluten Konzentrationen an Cholesterinvorstufen bzw. deren Ratio zu Cholesterin zur Beschreibung der Cholesterinbiosynthese in organischen Materialien wie Blut, Liquor, Fäzes oder Organpräparaten herangezogen. Die Serumkonzentrationen von Lanosterin (4,4´,14-Trimethylcholesta-8,24-dien-3β-ol), Desmosterin (Cholesta-5,24-dien-3β-ol) oder Lathosterin (Cholest-7-en-3β-ol) reflektieren die Aktivität der hepatischen 3- Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzyme-A- (HMG-CoA-) Reduktase (Enzyme classification [E.C.] 1.1.1.34)(Björkhem et al., 1987; Kempen et al., 1988; Miettinen et al., 1990; Reihner et al., 1990). Hierbei stellt das Lanosterin die erste steroidale Vorstufe in der Kaskade der Cholesterinsynthese dar (Abbildung 2).

1. EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG

1.1 Der Cholesterinstoffwechsel

1.1.1 Die Cholesterinbiosynthese und Sterinresorption

Wenige organische Moleküle haben ein so intensives und anhaltendes wissenschaftliches Interesse auf sich gelenkt wie das Cholesterin. Es ist das Paradebeispiel einer Janus-köpfigen Substanz, der Bösewicht, der einerseits Atherosklerose und kardiovaskuläre Erkrankungen verursacht, andererseits aber auch für den Aufbau von Zellmembranen lebensnotwendig ist (Bloch, 1992). Im gesunden menschlichen Organismus stehen körpereigene Synthese, intestinale Aufnahme über die Nahrung, Veresterung durch spezifische Enzyme, extrazellulärer Transport mittels Lipoproteinen, und biliäre Ausscheidung des Cholesterins - in unveränderter oder in metabolisierter Form als Gallensäuren - miteinander im Gleichgewicht. Cholesterin ist ein sehr hydrophobes Molekül mit einer begrenzten Polarität aufgrund der β-ständigen Hydroxylgruppe am C3-Atom (Abb.1). Durch seine Hydrophobizität bestimmt es wesentlich die Zellmembranfluidität. Auf der anderen Seite macht diese Lipophilität des Cholesterins spezielle Mechanismen für seinen Transport in wässriger Umgebung notwendig.

Whs 05a source.png

Abb. 1 Strukturformel von Cholesterin (Cholest-5-en-3β-ol); die C-Atome sind systematisch durchnummeriert (Fieser und Fieser, 1961)

[Seite 9]

Häufig werden die absoluten Konzentrationen an Cholesterinvorstufen bzw. deren Ratio zu Cholesterin zur Beschreibung der Cholesterinbiosynthese in organischen Materialien wie Blut, Liquor, Fäzes oder Organpräparaten herangezogen. Die Serumkonzentrationen von Lanosterin, Desmosterin oder Lathosterin reflektieren die Aktivität der hepatischen HMGCoA Reduktase (Björkhem et al., 1987; Kempen et al., 1988; Miettinen et al., 1990; Reihner et al., 1990).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[2.] Analyse:Whs/Fragment 006 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-02-12 05:54:22 SleepyHollow02
Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Whs

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 6, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 8, Zeilen: 2 ff.
Whs 06a diss.png

Abbildung 2 Steroidale Vorstufen der Cholesterinbiosynthese (modifiziert nach (Lütjohann et al., 2002))

Whs 06a source.png

Abb. 2 Steroidale Vorstufen der Cholesterinbiosynthese (modifiziert nach (Lütjohann et al., 2002))

Anmerkungen

Die Abbildung in der Originalquelle Lütjohann et al., 2002 unterscheidet sich von der Abbildung in der untersuchten Arbeit. Die Modifikationen stammen nicht von W. H. S.

Sichter
(Hindemith), SleepyHollow02

[3.] Analyse:Whs/Fragment 007 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-03-14 22:44:54 WiseWoman
Fragment, Gesichtet, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, Whs

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 7, Zeilen: 1 ff.
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 9 f., Zeilen: 9: 6 ff.; 10: 1-2
Neben Cholesterin und seinen endogenen Vorstufen findet man in Serum, Liquor und Organellen Strukturanaloge des Cholesterins, die pflanzlichen Sterine bzw. Phytosterine. Sie unterscheiden sich von Cholesterin durch zusätzliche Methyl- (Campesterin)- oder Äthylgruppierungen (Sitosterin) am C24-Atom der Seitenkette des Cholesteringerüstes. Diese Phytosterine können dem menschlichen Körper nur über die Nahrung zugeführt werden und werden größtenteils sehr rasch über sogenannte selektive ATP-bindende Kassettentransporter (ABCG5/G8) vom Enterozyten direkt oder im Hepatozyten über die Galle in den Darm ausgeschieden (Berge et al., 2002; Lee et al., 2001; Yu et al., 2004). Die Aufnahmerate der Phytosterine im Dünndarm ist deutlich geringer als die des Cholesterins. Mit zunehmender Lipophilität nimmt die Resorptionsrate für Sterine ab. Cholesterin wird zwischen 20-70%, Campesterin bis zu 15% und Sitosterin zu weniger als 5% im Dünndarm resorbiert. Das Verhältnis (Ratio) von Campesterin oder Sitosterin zu Cholesterin im Serum stellt einen Surrogatserum- oder plasmamarker für die Cholesterinresorptionsrate dar (Miettinen et al., 1990). Findet man in einem gesunden Organismus einen sehr hohen Gehalt an pflanzlichen Sterinen, so weist dies auf eine allgemein erhöhte Resorptionsrate für Sterine, insbesondere für Cholesterin hin. Die Konzentrationen o.g. Cholesterinvorstufen und pflanzlicher Sterine werden heutzutage mittels hochsensitiver und -selektiver Methoden wie z.B. der massenspektrometrischen Detektion nach gas- oder flüssigkeitschromatographischer Trennung bestimmt.

1.1.2 Der Cholesterinabbau

Cholesterin ist im gesunden Organismus die Vorstufe von Gallensäuren und Steroidhormonen. Die komplette Synthese der Gallensäuren findet in der Leber statt, Vorstufen findet man jedoch auch in anderen Zellen. Eines der bedeutendsten Enzyme der Gallensäurensynthese ist die hepatische Cholesterin 7α-Hydroxylase (Cyp 7A1, E.C. 1.14.13.17). Sie steuert den initialen und geschwindigkeitbestimmenden Schritt im „klassischen“ (neutralen) Weg der Gallensäurenbiosynthese des Säugerorganismus (Princen et al., 1997; Russell, 2000). Die Sterin 26-Hydroxylase (Cyp 27A1, E.C. 1.14.13.15) katalysiert die Hydroxylierung verschiedener Sterinsubstrate, einschliesslich Cholesterin, zur Synthese von 27-Hydroxycholesterin und weiteren Intermediaten der Gallensäurenbiosynthese (Andersson et al., 1989; Cali und Russell, 1991; Russell, 2000; Wikvall, 1984). Diese und folgende Reaktionen bilden den „sauren“ Weg der Gallensäurenbiosynthese.

Neben Cholesterin und seinen endogenen Vorstufen findet man in Serum, Liquor und Organellen Strukturanaloge des Cholesterins, die pflanzlichen Sterine. Sie unterscheiden sich von Cholesterin durch zusätzliche Methyl (Campesterin)- oder Äthyl- (Sitosterin) gruppierungen am C24-Atom der Seitenkette des Cholesteringerüstes. Diese Phytosterine können dem menschlichen Körper nur über die Nahrung zugeführt werden und werden größtenteils sehr rasch über sogenannte selektive ATP-bindende Kassettentransporter (ABCG5/G8) vom Enterozyten direkt oder im Hepatozyten über die Galle in den Darm ausgeschieden (Berge et al., 2002; Lee et al., 2001; Yu et al., 2004). Die Aufnahmerate der Phytosterine im Dünndarm ist deutlich geringer als die des Cholesterins. Mit zunehmender Lipophilität nimmt die Resorptionsrate für Sterine ab. Cholesterin wird zwischen 20-70%, Campesterin mit ca. 15% und Sitosterin zu weniger als 5% resorbiert. Das Verhältnis (Ratio) von Campesterin oder Sitosterin zu Cholesterin im Serum stellt ein Surrogatserum- oder plasmamarker für die Cholesterinresorptionsrate dar (Miettinen et al., 1990). Findet man in einem gesunden Organismus einen sehr hohen Gehalt an pflanzlichen Sterinen, so weist dies auf eine allgemein erhöhte Resorptionsrate für Sterine, insbesondere für Cholesterin hin. Die Konzentrationen o.g. Cholesterinvorstufen und pflanzlicher Sterine werden heutzutage mittels hochsensitiver und -selektiver Methoden wie z.B. der massenspektrometrischen Detektion nach gas- oder flüssigkeitschromatographischer Separierung der Sterine bestimmt.

1.1.2 Der Cholesterinabbau

Cholesterin ist im gesunden Organismus Vorstufe von Gallensäuren und Steroidhormonen. Die komplette Synthese der Gallensäuren findet in der Leber statt, Vorstufen findet man jedoch auch in anderen Zellen. Eines der bedeutendsten Enzyme der Gallensäurensynthese ist die hepatische Cholesterin 7α-Hydroxylase (Cyp 7A1). Sie steuert den initialen und geschwindigkeitbestimmenden Schritt im „klassischen“ (neutralen) Weg der Gallensäurenbiosynthese des Säugerorganismus (Princen et al., 1997; Russell, 2000). Die Sterin 27-Hydroxylase (Cyp 27A1) katalysiert die Hydroxylierung verschiedener Sterinsubstrate, einschliesslich Cholesterin, zur Synthese von 27-Hydroxycholesterin und weiteren Intermediaten der Gallensäurenbiosynthese (Andersson et al., 1989; Cali und

[Seite 10]

Russell, 1991; Russell, 2000; Wikvall, 1984). Diese und weitere Reaktionen bilden den „sauren“ Weg der Gallensäurenbiosynthese (Abb. 3).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), WiseWoman

[4.] Analyse:Whs/Fragment 008 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-03-14 22:51:26 WiseWoman
Fragment, Gesichtet, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, Whs

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 8, Zeilen: 1-24
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 103 f., Zeilen: 10: 11 ff.; 11: 1 ff.
1.1.3 Der Cholesterinstoffwechsel im Gehirn

Über viele Jahre hinweg wurde der Cholesterinstoffwechsel im Gehirn weitgehend ignoriert, da dieses Organ für die Sterinökonomie im gesamten Organismus von geringer Bedeutung ist und nicht auf die Kontrollmechanismen reagiert, die für die Einhaltung des Steringleichgewichtes in den meisten anderen Organen, hauptsächlich in der Leber, verantwortlich sind (Dietschy und Turley, 2001). Jedoch müssen Neurone, wie alle anderen Zelltypen auch, kontinuierlich mit freiem Cholesterin versorgt werden, welches entweder intrazellulär durch de novo Synthese entsteht oder aus der extrazellulären Umgebung unter Verwendung spezifischer Liganden und Membrantransporter aufgenommen wird (de Chaves et al., 1997). Nahezu ein Viertel des nicht-veresterten Gesamtkörper-Cholesterins ist im zentralen Nervensystem (ZNS) enthalten, obwohl dieses nur ungefähr 2% der Gesamtkörpermasse ausmacht. Sehr wenig Cholesterin (<1%) wird von zirkulierenden Lipoproteinen über die protektive Blut-Hirn-Schranke aufgenommen (Dietschy und Turley, 2004). Neben einem geringen Abtransport über Lipoproteine, insbesondere über Apolipoprotein E, muss es für Cholesterin weitere Möglichkeiten geben, die Blut-Hirn-Schranke zu seiner Elimination zu überwinden (Pitas et al., 1987). 24S-Hydroxycholesterin, welches sich als Umwandlungs- und Transportform für Cholesterin (Björkhem et al., 1998; Lütjohann et al., 1996) aus dem Gehirn via Blut-Hirn-Schranke zur Peripherie zeigt, wird zunehmend als Liquor- oder Plasmamarker für das Cholesteringleichgewicht bzw. für seine Regulation im menschlichen Gehirn verwendet (Björkhem et al., 2001; Bretillon et al., 2000a; Bretillon et al., 2000b; Fassbender et al., 2002; Holdenrieder et al., 2004; Kölsch et al., 2004; Kölsch et al., 2002; Kölsch et al., 2003; Lütjohann et al., 2001; Lütjohann et al., 1996; Lütjohann et al., 2000; Lütjohann et al., 2004; Lütjohann und von Bergmann, 2003; Papassotiropoulos et al., 2002; Papassotiropoulos et al., 2000; Schonknecht et al., 2002).

1.1.3 Der Cholesterinstoffwechsel im Gehirn

Über viele Jahre hinweg wurde der Cholesterinstoffwechsel im Gehirn weitgehend ignoriert, da dieses Organ für die Sterinökonomie im gesamten Organismus von geringer Bedeutung ist und nicht auf die Kontrollmechanismen reagiert, die für die Einhaltung des Steringleichgewichtes in den meisten anderen Organen, hauptsächlich in der Leber, verantwortlich sind (Dietschy und Turley, 2001). Jedoch müssen Neurone, wie alle anderen Zelltypen auch, kontinuierlich mit freiem Cholesterin versorgt werden, welches entweder

[Seite 11]

intrazellulär durch de novo Synthese entsteht oder aus der extrazellulären Umgebung unter Verwendung spezifischer Liganden und Membrantransporter aufgenommen wird (de Chaves et al., 1997). Nahezu ein Viertel des nicht-veresterten Gesamtkörper-Cholesterins ist im zentralen Nervensystem (ZNS) enthalten, obwohl dieses nur ungefähr 2% der Gesamtkörpermasse ausmacht. Sehr wenig Cholesterin (<1%) wird von zirkulierenden Lipoproteinen über die protektive Blut-Hirn-Schranke aufgenommen (Dietschy und Turley, 2004). Neben einem geringen Abtransport über Lipoproteine, insbesondere über Apolipoprotein E, muss es für Cholesterin weitere Möglichkeiten geben, die Blut-Hirn- Schranke zu seiner Elimination zu überwinden (Pitas et al., 1987).

[...]

24S-Hydroxycholesterin, welches sich als Umwandlungs- und Transportform für Cholesterin aus dem Gehirn via Blut-Hirn-Schranke zur Peripherie zeigt, wird zunehmend als Liquor oder Plasmamarker für das Cholesteringleichgewicht bzw. für seine Regulation im menschlichen Gehirn verwendet (Björkhem et al., 2001; Bretillon et al., 2000a; Bretillon et al., 2000b; Fassbender et al., 2002; Holdenrieder et al., 2004; Kölsch et al., 2004; Kölsch et al., 2002; Kölsch et al., 2003; Lütjohann et al., 2001; Lütjohann et al., 1996; Lütjohann et al., 2000; Lütjohann et al., 2004; Lütjohann und von Bergmann, 2003; Papassotiropoulos et al., 2002; Papassotiropoulos et al., 2000; Schönknecht et al., 2002).

Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), WiseWoman

[5.] Analyse:Whs/Fragment 011 14 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-02-14 07:18:56 SleepyHollow02
Fragment, KeineWertung, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Whs, ZuSichten

Typus
KeineWertung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 11, Zeilen: 14 ff.
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 28, 30 f., Zeilen: 28: 13 ff.; 30: 28 ff.; 31: 1 ff.
Diese Untersuchungen folgten den Prinzipien der Helsinki-Deklaration zur Durchführung von klinischen Studien am Menschen unter ethischen Gesichtspunkten. Alle Teilnehmer unterschrieben vor Eintritt in die Studie eine Einverständniserklärung. Die lokale Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Marburg gab ihr Positivvotum. Eine weitere Lipid-senkende Therapie war ausgeschlossen. Die Probanden wurden gebeten, für die Dauer der Studie weder Ess- und Rauchgewohnheiten noch körperliche Aktivität zu ändern. Ausschlusskriterien waren kardiovaskuläre, thromboembolische und endokrinologische Erkrankungen in der Vorgeschichte und erhöhter Konsum von Alkohol oder Drogen sowie auch relevante Abweichungen klinisch-chemischer Laborparameter von Leber- und Nierenfunktion. 2.2 Probennahme und -asservierung Venöse Blutabnahmen wurden unmittelbar vor Studienbeginn als Basismessung sowie im Studienverlauf nach 6, 12 und 18 Wochen nach aufsteigender Dosierung der Medikation durchgeführt. Dazu mussten die Probanden nüchtern sein und eine wenigstens 10-stündige Rauch- sowie 24-stündige Alkoholkarenz einhalten. Die Blutentnahmen erfolgten dann zwischen 8 und 10 Uhr morgens nach einer wenigstens 20-minütigen Ruhepause kurz vor der Infusion einer 2H3-Leucin-Lösung. Die Proben wurden innerhalb einer Stunde nach Entnahme bei 3000g und 4°C für 30 Minuten zentrifugiert und nach Aufteilung in Aliquots (1 ml Eppendorfgefäße) in flüssigem Stickstoff schockgefroren bei -70°C bis zum Zeitpunkt der Analyse aufbewahrt. Da nach der Zentrifugation dem Serum kein Antioxidanz wie z. B. 3,5- [di-tert-Butyl-4-Hydroxy-Toluol (BHT; Merck, KGaA, Darmstadt) zugesetzt wurde, konnten wir nicht ausschließen, dass ein gewisser Anteil von Cholesterin bei der Probenasservierung und vor der Aufarbeitung bereits autoxidativ in 7α-Hydroxycholesterin umgewandelt wurde.] Diese Untersuchungen folgten den Prinzipien der Helsinki-Deklaration zur Durchführung von klinischen Studien am Menschen unter ethischen Gesichtspunkten. Alle Teilnehmer unterschrieben vor Eintritt in die Studie eine Einverständniserklärung. Die lokale Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Freien Universität Amsterdam gab ihr Positivvotum. Die Teilnehmerinnen waren zwischen 47 und 60 Jahre alt. Die letzte Menstruation war zwischen 6 und 24 Monaten vor Eintritt in die Studie, die FSH-Konzentration betrug über 30 IU/L und es bestanden bei keiner Teilnehmerin intolerable klimakterische Beschwerden. Der Body-Mass-Index lag zwischen 18 und 41.4 kg/m2 und der Gesamtcholesteringehalt im Serum war unter 300 mg/dL (8 mmol/L). Eine Lipid senkende Therapie war ausgeschlossen. Die Probandinnen wurden gebeten, für die Dauer der Studie weder Ess- und Rauchgewohnheiten noch körperliche Aktivität zu ändern. Ausschlusskriterien waren kardiovaskuläre, thromboembolische und endokrinologische Erkrankungen in der Vorgeschichte, östrogenabhängige Neoplasien und erhöhter Konsum von Alkohol oder Drogen sowie auch relevante Abweichungen klinischchemischer Laborparameter von Leber- und Nierenfunktion.

[Seite 30:]

Venöse Blutabnahmen wurden unmittelbar vor Studienbeginn als Basismessung sowie im Studienverlauf nach 6, 12 und 24 Monaten durchgeführt. Dazu mussten die Probanden nüchtern sein und eine wenigstens 10-stündige Rauch- sowie 24-stündige Alkoholkarenz einhalten. Die Blutentnahmen erfolgten dann zwischen 8 und 10 Uhr morgens nach einer wenigstens 20-minütigen Ruhepause. Die Proben wurden innerhalb einer Stunde nach

[Seite 31:]

Entnahme bei 3000g und 4°C für 30 Minuten zentrifugiert und nach Aufteilung in Aliquots (1 ml Eppendorfgefäße) in flüssigem Stickstoff schockgefroren bei -70°C bis zum Zeitpunkt der Analyse aufbewahrt. Da nach der Zentrifugation dem Serum kein Antioxidanz wie z. B. 3,5- di-tert-butyl-4-hydroxytoluol (BHT) zugesetzt wurde, konnten wir nicht ausschließen, dass ein gewisser Anteil von Cholesterin bei der Probenasservierung und vor der Aufarbeitung bereits autoxidativ in 7α-Hydroxycholesterin umgewandelt wurde.

Anmerkungen

Aus dem Material & Methoden- Teil. Daher auch Einordnung als kW möglich.

Sichter
(SleepyHollow02)

[6.] Analyse:Whs/Fragment 012 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-02-14 07:27:01 SleepyHollow02
Fragment, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, Whs, ZuSichten

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 12, Zeilen: 1 ff.
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 31 ff., Zeilen: 31: 3 ff.; 32: 26 ff.; 33: 1 ff.
[Da nach der Zentrifugation dem Serum kein Antioxidanz wie z. B. 3,5-]

di-tert-Butyl-4-Hydroxy-Toluol (BHT; Merck, KGaA, Darmstadt) zugesetzt wurde, konnten wir nicht ausschließen, dass ein gewisser Anteil von Cholesterin bei der Probenasservierung und vor der Aufarbeitung bereits autoxidativ in 7α-Hydroxycholesterin umgewandelt wurde. Daher verzichteten wir in unserer Untersuchung auf die Bestimmung dieser Gallensäurenvorstufe.

2.3 Probenaufarbeitung

Die Sterine in den Serumproben werden zur gaschromatographischen (GC) Trennung mit anschließender Flammenionisationsdetektion (FID) oder massenselektiver Detektion (MSD) im Scan oder Selected Ion-Monitoring (SIM) Modus zunächst in ihre freie Form gebracht, indem durch eine alkalische Hydrolyse die fettsäureveresterten Sterine dekonjugiert werden. Danach werden die freien Sterine extrahiert und mittels eines Silylierungsreagenzes in einen Silylsterinäther umgewandelt (Lütjohann et al., 2000).

→ Die tiefgefrorenen Serumproben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut.

→ 1 μg Epicoprostanol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München) (10 μl einer Stammlösung von 100 μg/ml in Cyclohexan, Merck KGaA, Darmstadt), 50 μg 5α- Cholestan (Serva Feinbiochemika GmbH, Heidelberg) (50 μl einer Stammlösung von 1 mg/ml in Cyclohexan) und jeweils 100 ng razemisches [23,23,24,25-2H4]24(R,S)- Hydroxycholesterin (Klinische Chemie, Karolinska-Institut, Stockholm, Schweden, (Dzeletovic et al., 1995)) und [15,16,17,20,22-2H5]27-Hydroxycholesterin (Klinische Chemie, Karolinska-Institut, Stockholm, Schweden, (Dzeletovic et al., 1995)) (100 μl einer Stammlösung eines Gemisches von [2H4]24(R,S)-Hydroxycholesterin und [2H5]27-Hydroxycholesterin, 1 μg/ml in MeOH, Merck, KGaA, Darmstadt) wurden als interne Standards zu 200 μl der Serumprobe bei Raumtemperatur in einem Teflon-beschichteten Reagenzglas mit Schraubverschluss zugesetzt.

→ Zur Vermeidung von weiteren autoxidativen Prozessen wurden außerdem noch 50 ng BHT (10 μl aus einer Stammlösung von 50 mg BHT/10 ml MeOH) zugesetzt.

→ Zur alkalischen Hydrolyse wurde das Probengemisch nach Zusatz von 1 ml 90%-iger äthanolischer NaOH-Lsg. (1M) (Merck, KGaA, Darmstadt) im Wasserbad bei 68°C über 1 Stunde inkubiert.

→ Nach Abkühlen auf Raumtemperatur und Zusatz von 500 μl aqua bidest. wurden die freien Sterine zweimal in 3 ml Cyclohexan (Merck KGaA, Darmstadt) extrahiert.

Da nach der Zentrifugation dem Serum kein Antioxidanz wie z. B. 3,5- di-tert-butyl-4-hydroxytoluol (BHT) zugesetzt wurde, konnten wir nicht ausschließen, dass ein gewisser Anteil von Cholesterin bei der Probenasservierung und vor der Aufarbeitung bereits autoxidativ in 7α-Hydroxycholesterin umgewandelt wurde. Daher verzichteten wir in unserer Untersuchung auf die Bestimmung dieser Gallensäurenvorstufe.


[Seite 32:]

2.5 Probenaufarbeitung

Die Sterine in den Serumproben werden zur gaschromatographischen Trennung mit anschließender Flammenionisationsdetektion oder massenselektiver Detektion zunächst in ihre freie Form gebracht, indem durch eine alkalische Hydrolyse die fettsäureveresterten Sterine dekonjugiert werden. Danach werden die freien Sterine extrahiert und mittels eines Silylierungsreagenzes in einen Silylsterinäther umgewandelt.

[Seite 33:]

􀂾 Die tiefgefrorenen Serumproben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut.

􀂾 1 μg Epicoprostanol (10 μl einer Stammlösung von 100 μg/ml in Cyclohexan), 50 μg 5α-Cholestan (50 μl einer Stammlösung von 1 mg/ml in Cyclohexan) und jeweils 100 ng razemisches [23,23,24,25-2H4]24R,S-Hydroxycholesterin und [15,16,17,20,22- 2H5]27-Hydroxycholesterin (100 μl einer Stammlösung eines Gemisches von [2H4]24R,S-Hydroxycholesterin und [2H5]27-Hydroycholesterin, 1 μg/ml in MeOH) wurden als interne Standards zu 200 μl der Serumprobe bei Raumtemperatur in einem Teflon-beschichteten Reagenzglas mit Schraubverschluss zugesetzt.

􀂾 Zur Vermeidung von autoxidativen Prozessen wurden außerdem noch 50 ng 3,5-ditert- butyl-4-hydroxytoluene (BHT) (10 μl aus einer Stammlösung von 50 mg BHT/10 ml MeOH) zugesetzt.

􀂾 Zur alkalischen Hydrolyse wurde das Probengemisch nach Zusatz von 1 ml 90%-iger äthanolischer NaOH-Lsg. (1M) im Wasserbad bei 68°C über 1 Stunde inkubiert.

􀂾 Nach Abkühlen auf Raumtemperatur und Zusatz von 500 μl aqua bidest. wurden die freien Sterine, Stanole und Oxysterine zweimal in 3 ml Cyclohexan extrahiert.

Anmerkungen

Aus dem Material & Methoden-Teil - daher auch Einordnugn als kW möglich.

Sichter
(SleepyHollow02)

[7.] Analyse:Whs/Fragment 013 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-02-14 07:35:24 SleepyHollow02
Fragment, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, Whs, ZuSichten

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 13, Zeilen: 1 ff.
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 33 ff., Zeilen: 33: 16 ff; 34: 3 ff.; 35: 22 ff.; 36: 13 ff. 37: 1 f.
→ Die vereinigten organischen Phasen wurden unter Stickstoffbegasung bei 65°C

getrocknet.

→ Die Hydroxylgruppen der Sterine wurden nach Zugabe von 1 ml eines Trimethylsilylierungs- (TMS-) Reagenzes (Pyridin-Hexamethyldisilazan- Trimethylchlorsilan, 9:3:1; v/v/v) (Merck, KGaA, Darmstadt) zum Rückstand nach 1- stündiger Inkubation bei 65°C zu TMS-Äthern derivatisiert.

→ Die restlichen Silylierungsreagenzien wurden daraufhin unter Stickstoffbegasung bei 65°C verdampft.

→ Der Rückstand wurde in 160 μl n-Dekan (Merck KGaA, Darmstadt) gelöst.

→ 80 μl dieses Gemisches an Sterintrimethylsilyläthern in n-Dekan wurden in die Mikroeinsätze der Glasphiolen für die GC-MSD-Analyse überführt.

→ Die übrigen 80 μl wurden mit 500 μl n-Dekan für die GC-FID-Analyse verdünnt.

→ Die Glasphiolen wurden zur eindeutigen Identifizierung beschriftet.


2.4 Beschreibung der Analyseverfahren

Cholesterinvorstufen und -metabolite wie das 24S- und das 27-Hydroxycholesterin liegen im Serum in einer 103 bis 104-fach geringeren Konzentration als ihre Ausgangssubstanz Cholesterin vor. Daher wird die Konzentration des Cholesterins in Serumproben durch die weniger spezifische und selektive Flammenionisationsdetektion nach gaschromatographischer Trennung bestimmt, während die Cholesterinvorstufen und - metabolite durch die hochspezifische und -sensitive massenselektive Detektion aus der gleichen Probenaufarbeitung erfasst werden. Die Identifizierung von Cholesterin erfolgt über den Vergleich der Retentionszeiten mit zertifizierter Referenzsubstanz und die Quantifizierung erfolgt über einen zu Beginn der Aufarbeitung zugesetzten internen Standard (5α-Cholestan), der physiologischerweise nicht im Serum enthalten ist und dem zu bestimmenden Sterin chemisch möglichst ähnlich ist.

Nutzt man die Massenspektrometrie zur Strukturidentifizierung, muss eine kontinuierliche Aufnahme von Massenspektren über einen großen Massenbereich (z.B. 50-600 m/z) erfolgen (Scan Modus), d.h. man registriert alle Ionen, in die eine Substanz zerfällt, nach Masse- Ladungs-Verhältnis und nach relativer Intensität. Bei der Quantifizierung beschränkt man sich auf die Aufzeichnung von wenigen charakteristischen Massen, bei denen die Verbindung Fragmente höchster Intensität bildet (SIM Modus). Die Messzeit auf den ausgewählten und zyklisch registrierten Massen wird verlängert und so die Empfindlichkeit der Messung (Sensitivität) um den Faktor 30 bis 50 gesteigert (Hübschmann, 1996).

􀂾 Die vereinigten organischen Phasen wurden unter Stickstoffbegasung bei 65°C getrocknet.

􀂾 Die Hydroxylgruppen der Sterine und Stanole wurden nach Zugabe von 1 ml eines Trimethylsilylierungsreagenzes (Pyridin-Hexamethyldisilasan-Trimethylchlorsilan, 9:3:1; v/v/v) zum Rückstand nach 1-stündiger Inkubation bei 65°C zu Trimethylsilyläthern derivatisiert. Als Beispiele sind die Silylierungen von 24S- und 27-Hydroxycholesterin in Abb. 9 aufgeführt.

􀂾 Die restlichen Silylierungsreagenzien wurden daraufhin unter Stickstoffbegasung bei 65°C verdampft.

􀂾 Der Überstand wurde in 160 μl n-Dekan gelöst.

􀂾 80 μl dieses Gemisches an Sterintrimethylsilyäthern in n-Dekan wurden in die Mikroeinsätze der Glasphiolen für die GC-MSD-Analyse überführt.

􀂾 Die übrigen 80 μl wurden mit 500 μl n-Dekan für die GC-FID-Analyse verdünnt.

􀂾 Die Glasphiolen wurden zur eindeutigen Identifizierung beschriftet.

[Seite 34:]

2.6 Beschreibung der Analyseverfahren

Cholesterinvorstufen und -metabolite wie das 24S- und das 27-Hydroxycholesterin liegen im Serum in einer 103 bis 104-fach geringeren Konzentration als ihre Ausgangssubstanz Cholesterin vor. Daher wird die Konzentration des Cholesterins in Serumproben durch die weniger spezifische und selektive Flammenionisationsdetektion bestimmt, während die Cholesterinvorstufen und -metabolite durch die hochspezifische massenselektive Detektion erfasst werden.

[Seite 35:]

Die Quantifizierung erfolgt über einen zu Beginn der Aufarbeitung zugesetzten internen Standard (5α-Cholestan), der physiologischerweise nicht im Serum enthalten ist, und der zu bestimmenden Substanz chemisch möglichst ähnlich ist.

[Seite 36:]

Nutzt man die Massenspektrometrie zur Strukturidentifizierung, muss eine kontinuierliche Aufnahme von Massenspektren über einen großen Massenbereich (z.B. 50-600 m/z) erfolgen (Scan-Modus), d.h. man registriert alle Ionen, in die eine Substanz zerfällt, nach Masse-Ladungs-Verhältnis und nach relativer Intensität. Dabei ist die Messzeit auf jeder Masse kurz. Das erhaltene Massenspektrum ist wie ein „Fingerabdruck” für die zu untersuchende Substanz. Bei der Quantifizierung beschränkt man sich auf die Aufzeichnung von wenigen charakteristischen Massen, bei denen die Verbindung Fragmente höchster Intensität bildet (Selected Ion- Monitoring [SIM] Modus). Die Messzeit auf den ausgewählten und zyklisch registrierten Quadrupolstäbe

[Seite 37:]

Massen wird verlängert und so die Empfindlichkeit der Messung um den Faktor 30 bis 50 gesteigert (Hübschmann, 1996).

Anmerkungen

Aus dem MAterial & Methoden-Teil. Daher auch Einordnung als kW möglich.

Sichter
(SleepyHollow02)

[8.] Analyse:Whs/Fragment 014 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-02-14 07:39:46 SleepyHollow02
Fragment, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, Whs, ZuSichten

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 14, Zeilen: 1 ff.
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 37, Zeilen: 8 ff.
[Zur quantitativen] Bestimmung von Cholesterinvorstufen und pflanzlichen Sterinen wird Epicoprostanol, ein nicht-physiologisches Stanol, und zur Bestimmung von Oxysterinen werden mehrfach deuterierte Oxysterine als interne Standards verwendet. Die mit stabilen Isotopen markierten Oxysterine weisen aufgrund ihrer chemischen Ähnlichkeit zu den nicht-deuterierten Substanzen das gleiche Verteilungsverhalten auf und unterscheiden sich von den authentischen Substanzen lediglich in der Masse ihrer Hauptfragmente, so dass sie

massenspektrometrisch voneinander getrennt erfasst werden können. Die deuterierten Oxysterole weisen im Vergleich zu den nicht-deuterierten Substanzen leicht verkürzte Retentionszeiten auf (Hübschmann, 1996). Das Epicoprostanol und die stabilen Isotope werden den Proben ebenfalls vor Beginn der Aufarbeitung zugesetzt. Das Massenspektrum der TMS-Derivate von 24S-OH-Chol und 27-OH-Chol im Vergleich zu ihren deuterierten Verbindungen ist in Abbildung 3 dargestellt. Das Massenspektrum des TMS-Derivates von 24S-OH-Chol (Masse = 546) weist 2 Fragmente mit Massen von m/z 503 und m/z 456 auf, was einer Abspaltung der Isopropylgruppe [M+(-43)] bzw. der Trimethylsilanolgruppe [M+(- 90)] entspricht (Abbildung 3A). Diese Ionen weisen zwar höhere Massen aber geringere Intensitäten auf als das Fragment mit Masse m/z 413. Dieses charakteristische Fragment höchster Intensität entsteht durch Abspaltung sowohl der Isopropyl- als auch der Trimethylsilanolgruppe [M+(-43)(-90)] und wird daher im SIM-Modus hier massenselektiv detektiert. Das Molekülion [M+] der Masse m/z 546 tritt im Massenspektrum von 24S-OHChol sowie in dem von 27-OH-Chol auf, da beide Verbindungen gleiches Molekulargewicht besitzen. Das Fragment der Masse m/z 456, welches durch Abspaltung der Trimethylsilanolgruppe [M+(-90)] aus dem TMS Derivat von 27-OH-Chol entsteht, hat die höchste Masse und Intensität und dient daher der Bestimmung von 27-OH-Chol (Abbildung 3C). Die deuterierten Standards werden auf den entsprechend höheren Massen gemessen (Abbildungen 3B und 3D). Für den vierfach deuterierten Standard [23,23,24,25-2H4]24(R,S)- OH-Chol reduziert sich die Markierung nach Fragmentierung auf eine dreifache Deuterierung, so dass das Fragment höchster Intensität die Masse m/z 416 aufweist. Bei [15,16,17,20,22- 2H5]27-OH-Chol bleibt auch nach der Fragmentierung die fünffache Deuterierung erhalten, die Verbindung wird daher auf der Masse m/z 461 massenselektiv detektiert.

Die mit stabilen Isotopen markierten Oxysterine weisen aufgrund ihrer chemischen Ähnlichkeit zu den nicht-deuterierten Substanzen das gleiche Verteilungsverhalten auf und unterscheiden sich von den authentischen Substanzen lediglich in der Masse ihrer Hauptfragmente, so dass sie massenspektrometrisch voneinander getrennt erfasst werden. Durch Dampfdruckisotopeneffekte weisen die deuterierten Isotope im Vergleich zu den nicht-deuterierten Substanzen leicht verkürzte Retentionszeiten auf (Hübschmann, 1996). Das Epicoprostanol und die stabilen Isotope werden den Proben ebenfalls vor Beginn der Aufarbeitung zugesetzt. Das Massenspektrum der TMS-Derivate von 24S-OH-Chol und 27-OH-Chol im Vergleich zu ihren deuterierten Verbindungen ist in Abb. 14 dargestellt. Zur Interpretation eines Massenspektrums werden die intensitätsstärksten Ionen und die größten Fragmente gemessen, da letztere molekülspezifischer sind als kleinere Fragmente. Das Massenspektrum des TMSDerivates von 24S-OH-Chol (Masse = 546) weist 2 Fragmente mit Massen von 503 und 456 auf, was einer Abspaltung der Isopropylgruppe [M+(-43)] bzw. der Trimethylsilanolgruppe [M+(-90)] entspricht (Abb. 11A). Diese Ionen weisen zwar höhere Massen aber geringere Intensitäten auf als das Fragment mit Masse 413. Dieses charakteristische Fragment höchster Intensität entsteht durch Abspaltung sowohl der Isopropyl- als auch der Trimethylsilanolgruppe [M+(-43)(-90)] und wird daher im SIM-Modus hier massenselektiv detektiert. Das Molekülion [M+] der Masse 546 tritt im Massenspektrum von 24S-OH-Chol sowie in dem von 27-OH-Chol auf, da beide Verbindungen gleiches Molekulargewicht besitzen. Das Fragment der Masse 456, welches durch Abspaltung der Trimethylsilanolgruppe [M+(-90)] aus dem TMS Derivat von 27-OH-Chol entsteht, hat die höchste Masse und Intensität und dient daher der Bestimmung von 27-OH-Chol (Abb. 11C). Die deuterierten Standards werden auf den gleichen Fragmenten, die jeweils um den Grad ihrer Markierung erhöhte Massen aufweisen, gemessen (Abb. 11B und 11D). Für den vierfach deuterierten Standard [23,23,24,25-2H4]24-OH-Chol reduziert sich die Markierung nach Fragmentierung auf eine dreifache Deuterierung, so dass das Fragment höchster Intensität die 38 Masse 416 aufweist. Bei [15,16,17,20,22-2H5]27-OH-Chol bleibt auch nach der Fragmentierung die fünffache Deuterierung erhalten, die Verbindung wird daher auf der Masse 461 massenselektiv detektiert.
Anmerkungen

Aus dem Material & Methoden-Teil. Daher auch Einordnung als kW möglich.

Sichter
(SleepyHollow02)

[9.] Analyse:Whs/Fragment 015 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-02-12 05:48:55 SleepyHollow02
Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Whs

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 15, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 39, Zeilen: 1: 1 ff.; 1: left col.: 25 ff.; right col.: 8 ff.
Whs 15a diss.png

Abbildung 3

Massenspektren der Trimethylsilyl-Derivate von 24SHydroxycholesterin (A) und des vierfach deuterierten racemischen Gemisches (B) sowie von 27-Hydroxycholesterin (C) und seiner fünffach deuterierten Verbindung (D)

Whs 15a source.png

Abb. 11

Massenspektrum der Trimethylsilyl-Derivate von 24SHydroxycholesterin (A) und seiner vierfach deuterierten Verbindung (B) sowie von 27-Hydroxycholesterin (C) und seiner fünffach deuterierten Verbindung (D)

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith), SleepyHollow02

[10.] Analyse:Whs/Fragment 016 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-02-14 07:45:59 SleepyHollow02
Fragment, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, Whs, ZuSichten

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
No.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 16, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 40 f., Zeilen: 40: 1 ff.; 41: 1 ff.
2.5 Durchführung der Analysen

2.5.1 Durchführung der Analyse mittels Gaschromatographie-Flammenionisationsdetektion

Das Sterintrimethylsilyläthergemisch wurde mit einem HP 7683 Injektor auf eine vernetzte Methylsilikon DB-XLB 122-1232 Kapillarsäule (J&W, Folsom, USA) (30m x 0,25 mm Innendurchmesser x 0,25 μm Schichtdicke) in einem Hewlett Packard Gaschromatographen (HP 6890) nach splittloser Injektion bei 280°C injiziert. Der Trägergasfluss – in unserem Falle: Wasserstoff - betrug 1,1 ml/min. Die Ofentemperatur wurde zu Beginn für 3 min bei 150°C gehalten und dann mit einer Steigerungsrate von 30°C/min auf eine Endtemperatur von 290°C geführt. Diese Temperatur blieb über 22,33 min konstant. Der interne Standard 5α- Cholestan wurde mit einer Retentionszeit von 12,0 min und der Cholesterintrimethylsilyläther mit einer Retentionszeit von 15,88 min im Flammenionisationsdetektor (FID) bei 280°C mit einem kombinierten konstanten Säulen- und Make-up-Fluss (Wasserstoff + Stickstoff; 30 ml/min) detektiert. Die Steuerung des Gaschromatographen und die Auswertung der Gaschromatogramme sowie die Quantifizierung erfolgte durch die HP GC ChemStation Software (Version 2.1.1.0) auf einem Kayak XA Pentium II-Computer. Zur Quantifizierung wird die integrierte Fläche des Cholesterinpeaks durch die Fläche des 5α-Cholestanpeaks dividiert und mit dem vorgegebenen Gehalt an internem Standard von 50 μg multipliziert. Dies ergibt den Gehalt an Cholesterin in μg pro Probe. Bei einer eingesetzten Menge von 200 μl muss man diesen Betrag noch auf 100 ml umrechnen, um die Cholesterinkonzentration in mg/dl anzugeben. Zur Validierung dieser Einpunkt-Eichmethode mit 5α-Cholestan als internem Standard wurden die Ergebnisse der Serumkonzentrationen von Cholesterin einer Einpunkt-Eichung gegenüber einer erstellten Eichgerade verglichen. Die Ergebnisse zeigten gute Übereinstimmung beider Eichverfahren. Abbildung 3 zeigt die Eichkurve für Cholesterin mit 5α-Cholestan als internem Standard in einem Konzentrationsbereich zwischen 0 und 200 μg/Probe. Zur Präzision der Methode wurde die gleiche Serumprobe sechsfach aufgearbeitet und gemessen (Wiederholbarkeit), sowie eine aufgearbeitete Probe nach Silylierung sechsmal hintereinander injiziert um die Stabilität des Messinstrumentes zu zeigen. Für die Wiederholbarkeit der Einpunkt-Methode ergab sich ein Variationskoeffizient von 1,45 % (n=6) und für die Stabilitätsmessung des GC-FID ein Variationskoeffizient von 1,60 % (n=6). Die Nachweisgrenze einer Substanz wird normalerweise ermittelt, indem man bekannte niedrige Konzentrationen des Analyten mit substanzfreiem Medium gegenüberstellt und die minimale Konzentration ermittelt, bei der der Analyt gerade noch erfasst werden kann. Ein Signal-Rausch-Verhältnis von 3:1 wird zur Bestimmung der Nachweisgrenze akzeptiert. Bei der Bestimmung von Cholesterin im Serum gibt es bezüglich der Nachweisgrenze für [Cholesterin kein Problem.]

2.7 Durchführung der Analysen

2.7.1 Durchführung der Analyse mittels Gaschromatographie-Flammenionisationsdetektion

Das Sterintrimethylsilyläthergemisch wurde mit einem HP 7683 Injektor auf eine vernetzte Methylsilikon DB-XLB 122-1232 Kapillarsäule (J&W, Folsom, USA) (30m x 0,25 mm Innendurchmesser x 0,25 μm Schichtdicke) in einem Hewlett Packard Gaschromatographen (HP 6890) nach splittloser Injektion bei 280°C injiziert. Der Trägergasfluss – in unserem Falle: Wasserstoff - betrug 1,1 ml/min. Die Ofentemperatur wurde zu Beginn für 3 min bei 150°C gehalten und dann die Temperatur mit einer Steigerungsrate von 30°C/min auf eine Endtemperatur von 290°C geführt. Diese Temperatur blieb über 22,33 min konstant. Der interne Standard 5α-Cholestan wurde mit einer Retentionszeit von 12,0 min und der Cholesterintrimethylsilyläther mit einer Retentionszeit von 15,88 min im Flammenionisationsdetektor (FID) bei 280°C mit einem kombinierten konstanten Säulen- und Make-up-Fluss (Wasserstoff + Stickstoff; 30 ml/min) detektiert (Abb. 12). Die Steuerung des Gaschromatographen und die Auswertung der Gaschromatogramme sowie die Quantifizierung erfolgte durch die HP GC ChemStation Software (Version 2.1.1.0) auf einem Kayak XA Pentium II-Computer. Abbildung 15 zeigt eine gaschromatographische Trennung von 5α-Cholestan und Cholesterin. Zur Quantifizierung wird der integrierte Flächengehalt des Cholesterinpeaks durch den Flächengehalt des 5α-Cholestanpeaks dividiert und mit dem vorgegebenen Gehalt an internem Standard von 50 μg multipliziert. Dies ergibt den Gehalt an Cholesterin in μg pro Probe. Bei einer eingesetzten Menge von 200 μl muss man diesen Betrag noch auf 100 ml umrechnen, um die Cholesterinkonzentration in mg/dl anzugeben. Zur Validierung dieser Einpunkt-Eichmethode mit 5α-Cholestan als internem Standard wurden die Ergebnisse der Serumkonzentrationen von Cholesterin einer Einpunkt-Eichung gegenüber einer erstellten Eichgerade verglichen. Die Ergebnisse zeigten gute Übereinstimmung beider Eichverfahren. Abbildung 13 zeigt die Eichkurve für Cholesterin mit 5α-Cholestan als internem Standard in einem Konzentrationsbereich zwischen 0 und 200 μg/Probe. Zur Präzision der Methode wurde die gleiche Serumprobe sechsfach aufgearbeitet und gemessen (Wiederholbarkeit), sowie eine aufgearbeitete Probe nach Silylierung sechsmal hintereinander injiziert um die Stabilität des Messinstrumentes zu zeigen. Für die Wiederholbarkeit der Einpunkt-Methode ergab sich ein Variationskoeffizient von 1,45 (n=6) und für die Stabilitätsmessung des GC-FID ein Variationskoeffizient von 1,6 (n=6). Die Nachweisgrenze einer Substanz wird normalerweise ermittelt, indem man bekannte niedrige Konzentrationen des Analyten mit substanzfreiem Medium gegenüberstellt und die minimale

[Seite 41:]

Konzentration ermittelt, bei der der Analyt gerade noch erfasst werden kann. Ein Signal- Rausch-Verhältnis von 3:1 wird zur Bestimmung der Nachweisgrenze akzeptiert. Bei der Bestimmung von Cholesterin im Serum gibt es bezüglich der Nachweisgrenze für Cholesterin kein Problem. Daher wird die Nachweisgrenze (limit of detection) für die GC-FID-Methode auf < 0.1 mg/dl durch den niedrigsten Punkt unserer Eichkurve festgelegt. Für die Bestimmungsgrenze (Limit of quantitation) in biologischen Matrizes wird ein Signal- Rausch-Verhältnis von 10:1 festgelegt

Anmerkungen

Aus dem Material & Methoden-Teil; daher auch Einordnung als kW möglich.

Sichter
(SleepyHollow02)

[11.] Analyse:Whs/Fragment 017 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-02-12 05:56:57 SleepyHollow02
Fragment, Gesichtet, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, Whs

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 17, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 41, 42, Zeilen: 41: 4 ff; 42: 1 ff.
Daher wird die Nachweisgrenze für die GC-FID-Methode auf < 0.1 mg/dl durch den niedrigsten Punkt unserer Eichkurve festgelegt (Abbildung 4). Für die Bestimmungsgrenze in biologischen Matrizes wird ein Signal-Rausch-Verhältnis von 10:1 festgelegt. Der Einfluss der chromatographischen Basislinie kann für den Analyten Cholesterin vollständig vernachlässigt werden. Das Signal-Rausch-Verhältnis übersteigt hier die Bestimmungsgrenze erheblich. Die Reinheit der Referenzsubstanzen wurde mittels GC-FID und GC-MSD bestätigt und die Stammlösungen wurden bei 4°C unter Lichtausschluss aufbewahrt. Pipetten und Wägeeinheiten wurden turnusmässig validiert.

Whs 17a diss.png

Abbildung 4 Eichkurve für Cholesterin mit 5α-Cholestan als Internem Standard

2.5.2 Durchführung der Analyse mittels Gaschromatographie-massenselektiver Detektion

Die säulenchromatographische Trennung des Sterinsilylgemisches erfolgte auf einer 30 m DB-XLB Kapillarsäule mit Helium als Trägergas. Der Trägergasfluss betrug 1.0 ml/min. Das Temperaturprogramm startete gleichfalls mit 150°C für 1 min und wurde mit einer Steigerungsrate von 30°C/min auf 290°C fortgeführt. Die Endtemperatur wurde über 30 Minuten gehalten. Die Injektor- und Transferlinetemperatur wurde auf 280°C fest eingestellt. Die Multiplierspannung lag bei 2700 Volt. Der Elektronenstrom an der Kathode betrug 220 mA und die Elektronenimpakt-Ionisationsspannung wurde auf 70eV festgelegt. Das Selected-Ion-Monitoring wurde im Daten-Acquirierungsprogramm so eingestellt, dass der Quadrupolmassenfilter innerhalb einer Sekunde die gewählten m/z-Werte zweimal erfassen kann. Vor jeder größeren Analysensequenz wurde zur Optimierung der Messeigenschaften des MSD eine vorgegebene automatische Selbstjustierung mittels einer definierten Substanz (PFTBA – Perfluortributylamin, Agilent Technologies, Waldbronn) in Form eines „Autotunes“ durchgeführt.

Daher wird die Nachweisgrenze (limit of detection) für die GC-FID-Methode auf < 0.1 mg/dl durch den niedrigsten Punkt unserer Eichkurve festgelegt. Für die Bestimmungsgrenze (Limit of quantitation) in biologischen Matrizes wird ein Signal- Rausch-Verhältnis von 10:1 festgelegt. Der Einfluss der chromatographischen Basislinie kann für den Analyten Cholesterin vollständig vernachlässigt werden. Das Signal-Rausch- Verhältnis übersteigt hier die Bestimmungsgrenze erheblich. Die Reinheit der Referenzsubstanzen wurde mittels GC-FID und GC-MSD bestätigt und die Stammlösungen wurden bei 4°C unter Lichtausschluss aufbewahrt. Pipetten und Wägeeinheiten wurden turnusmässig validiert.

[Seite 42]

Whs 17a source.png

Abb. 13 Eichkurve für Cholesterin mit 5α-Cholestan als Internem Standard

2.7.2 Durchführung der Analyse mittels Gaschromatographie-massenselektiver Detektion

Die säulenchromatographische Trennung des Sterin-/Stanolsilylgemisches erfolgte auf einer 30 m DB-XLB Kapillarsäule mit Helium als Trägergas. Der Trägergasfluss betrug 1.0 ml/min. Das Temperaturprogramm startete gleichfalls mit einer Temperatur von 150°C für 1 min und wurde mit einer Steigerungsrate von 30°C/min auf 290°C fortgeführt. Die Endtemperatur wurde über 30 Minuten gehalten. Die Injektor- und Transferlinetemperatur wurde auf 280°C fest eingestellt. Die Multiplierspannung lag bei 2700 Volt. Der Elektronenstrom an der Kathode betrug 220 mA und die Elektronenimpakt- Ionisationsspannung wurde auf 70eV festgelegt. Das Selected-Ion-Monitoring für ausgewählte selektive Ionen wurde im Daten-Acquirierungsprogramm so eingestellt, dass der Quadrupolmassenfilter mit einer Zyklusrate von 2,0 Zyklen/sek innerhalb der gewählten m/z- Werte arbeitete. Vor jeder größeren Analysensequenz wurde zur Optimierung der Messeigenschaften des MSD eine vorgegebene automatische Selbstjustierung mittels einer definierten Substanz (PFTBA) in Form eines „Autotunes“ durchgeführt.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith), SleepyHollow02

[12.] Analyse:Whs/Fragment 018 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-02-12 06:01:27 SleepyHollow02
Fragment, Gesichtet, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, Whs

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 18, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 42, 43, Zeilen: 42: letzte Zeilen; 43: 1 ff.
[Der SIM-Modus wurde mit dem Ion m/z 370 für Epicoprostanol] (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München) begonnen. In Tabelle 1 sind die Retentionszeiten und spezifischen Massen für jede gemessene Substanz aufgelistet.

Tabelle 1 Parameter zur gaschromatographischen Trennung und massenselektiven Detektion von Trimethylsilylsterinäthern

Whs 18a diss.png

Für jedes zu messende Sterin wurde eine eigene Eichgerade erstellt, die darüber Aufschluss gab, ob integrierte Peakflächen und eingesetzte Substanzkonzentrationen linear verlaufen. Dies ist Voraussetzung für eine quantitative Bestimmung. Steigende Mengen an Sterinen und unmarkierten Oxysterinen, denen je gleiche Mengen an Epicoprostanol bzw. mit stabilen Isotopen markiertes 24(R,S)-Hydroxycholesterin und 27-Hydroxycholesterin zugesetzt wurden, wurden mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie im SIM Modus gemessen und das Verhältnis der Peakfläche des unmarkierten zu der des jeweiligen Internen Standards gegen die eingesetzten Substanzmengen (ng) aufgetragen.

Zur Identifizierung der jeweiligen Substanzen wurde die Identität der Massenspektren aller Substanzen, die mittels GC-MSD im SCAN Modus aus Serumproben bestimmt wurden, durch den Vergleich der Massenspektren mit authentischen Referenzsubstanzen bestätigt. Selbst Analyte, die gaschromatographisch nicht eindeutig voneinander abgetrennt werden konnten, konnten aufgrund ihrer spezifischen Massen im SIM Modus voneinander unterschieden und quantifiziert werden. Somit konnte z. B. das Lanosterin (Serva Feinbiochemika GmbH, Heidelberg) neben dem Sitosterin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München) bei sehr nahe beieinanderliegenden Retentionszeiten unterschieden werden.

Der SIM-Modus wurde mit dem Ion m/z 370 für Epicoprostanol begonnen. In Tabelle 2 sind die Retentionszeiten und spezifischen Massen für jede gemessene Substanz aufgelistet.

[Seite 43]

Tabelle 2 Parameter zur gaschromatographischen Trennung und massenselektiven Detektion von Trimethylsilylsterin- und stanoläthern

Whs 18a source.png

Für jedes zu messende Sterin, Stanol und Oxysterin wurde eine eigene Eichgerade erstellt, die darüber Aufschluss gab, ob integrierte Peakflächen und eingesetzte Substanzkonzentrationen linear verlaufen. Dies ist Voraussetzung für eine quantitative Bestimmung. Steigende Mengen an Sterinen, Stanolen und unmarkierten Oxysterinen, denen je gleiche Mengen an Epicoprostanol bzw. mit stabilen Isotopen markiertes 24R,S-Hydroxycholesterin und 27-Hydroxycholesterin zugesetzt wurden, wurden mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie im SIM-Modus gemessen und das Verhältnis der Peakfläche des unmarkierten zu der des jeweiligen Internen Standards gegen die eingesetzten Substanzmengen (ng) aufgetragen.

Zur Identifizierung der jeweiligen Substanzen wurde die Identität der Massenspektren aller Substanzen, die mittels GC-MSD-SIM aus Serumproben bestimmt wurden, durch den Vergleich der Massenspektren mit authentischen Referenzsubstanzen bestätigt. Selbst Analyte, die gaschromatographisch nicht eindeutig voneinander abgetrennt werden konnten, konnten aufgrund ihrer spezifischen Massen voneinander unterschieden und quantifiziert werden. Somit konnte z. B. das Lanosterin neben dem Sitosterin bei sehr nahe beieinanderliegenden Retentionszeiten unterschieden werden.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Die Tabelle der Quelle enthält eine Zeile mehr, sonst sind die Tabellen identisch.

Sichter
(Hindemith), SleepyHollow02

[13.] Analyse:Whs/Fragment 019 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2015-02-12 10:04:59 Klgn
Fragment, Gesichtet, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Verschleierung, Whs

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 19, Zeilen: 1-7
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 44, 47, Zeilen: 44: 1 ff.; 47: 1 ff.
Die Linearität der Eichkurven, die Spannweite und die Quantifizierungsgrenze wurde für jede einzelne Substanz überprüft und wir erhielten für die Sterine und Oxisterine folgende Charakteristika:

Tabelle 2 Eichgeradencharakteristika und Nachweisgrenzen

Whs 19a diss.png

2.6 Statistik

Alle Originaldaten wurden in Excel-Dateien eingetragen und in eine SPSS- (Statistical Package for the Social Sciences, Version 12.0, SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) Basisdatei zu weiteren statistischen Betrachtungen übertragen.

Die Linearität der Eichkurven, die Spannweite und die Quantifizierungsgrenze (QG) wurde für jede einzelne Substanz überprüft und wir erhielten für die Sterine und Stanole folgende Charakteristika:

Tabelle 3 Eichgeradencharakteristika und Nachweisgrenzen

Whs 19a source.png

[Seite 47]

2.8 Statistik

Alle Originaldaten wurden in Excel-Dateien eingetragen und in eine SPSS- (Statistical Package for the Social Sciences, Version 12.0, SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) Basisdatei zu weiteren statistischen Betrachtungen übertragen.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Die Tabelle der untersuchten Arbeit enthält eine Zeile weniger. Sehr bemerkenswert ist auch, dass alle Parameter der Eichgeraden für die aufgeführten Analyte identisch sind, nicht aber die R bzw. R^2 Werte. Es muss sich hier entweder um einen Fehler oder einen außerordentlichen Zufall handeln.

In der Spalte "Spannweite" wird bisweilen ein Punkt, bisweilen auch ein Komma verwendet, um die Dezimalstelle zu markieren. Diese Variation ist in untersuchter Arbeit und der Quelle identisch, was auf eine Übernahme im Copy-Paste-Stil hinweist.

Sichter
(Hindemith), SleepyHollow02

Auch bei Fandom

Zufälliges Wiki