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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 66, Zeilen: 25-45
Quelle: Müller 2001
Seite(n): 1, Zeilen: 16-35
4.5. Polymerasekettenreaktion

Das Prinzip der Polymerasekettenreaktion basiert auf der Denaturierung der doppelsträngigen DNA. Dabei entstehen zwei einzelne Stränge, an deren jeweiligen 5`- und 3`-Ende ein zu amplifizierender Bereich entsteht, an den sich spezifische Oligonucleotidmoleküle (Primer) anlagern können (Annealing).

Die Oligonucleotide werden von einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynucleosid-Triphosphate verlängert (elongiert).

Die DNA-Polymerase verlängert den entsprechenden DNA-Doppelstrang so lange, bis die Reaktion unterbrochen wird. Der Abbruch erfolgt in der Regel durch die Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 95 °C, die wiederum verbunden ist mit einer wiederholten Denaturierung der doppelsträngigen DNA.

Kühlt man den Ansatz in Anwesenheit freier Oligonucleotide auf 60-40 °C herunter, so binden sich diese in Abhängigkeit ihres mittleren Schmelzwertes an die komplementären Sequenzen der DNA-Matrize. Die Synthese eines weiteren Doppelstranges kann jetzt wiederholt werden.

Die Polymerasekettenreaktion bietet in Kombination mit einer thermostabilen DNA-Polymerase den Vorteil, dass alle Komponenten, wie z.B. Enzym, Matrize, Oligonucleotide, Desoxynucleosid-Triphosphate etc. in einem Reaktionsgefäß zusammengeführt und die DNA vollautomatisch in einem Thermocycler amplifiziert werden kann. Bei einer Durchführung von z. B. 25 PCR-Zyklen können aus einem Zielmolekül 3,2×107 Kopien hergestellt werden.

1.1 Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Das Prinzip der PCR lässt sich wie folgt beschreiben: Es basiert auf der Denaturierung einer doppelsträngigen DNA (dsDNA) (Abb. 1-1: A), an welche sich am 5`- und 3`-Ende des zu amplifizierenden Bereiches spezifische Oligonucleotidmoleküle anlagern (Annealing) (Abb. 1-1: B). Diese Oligonucleotide werden von einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynucleosid-Triphosphate (dNTPs) verlängert (elongiert) (Abb. 1-1: C). Die DNA-Polymerase elongiert den entstehenden DNA-Doppelstrang so lange, bis sie von der DNA ,abfällt` oder die Reaktion unterbrochen wird. Dieser Abbruch kann z.B. durch eine Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 95 °C verbunden mit einer wiederholten Denaturierung der dsDNA erfolgen. Kühlt man den Ansatz in Anwesenheit freier Oligonucleotide auf 60-40 °C herunter, so binden sich diese in Abhängigkeit ihres mittleren Schmelzwertes (Tm-Wertes) an die komplementären Sequenzen der DNA-Matrize (Abb. 1-1: D). Die Synthese eines weiteren Doppelstranges kann jetzt wiederholt werden (Abb. 1-1: E).

Die PCR bietet in Kombination mit einer thermostabilen DNA-Polymerase den Vorteil, dass alle Komponenten (Enzym, Matrize, Oligonucleotide, dNTPs, etc.) in einem Reaktionsgefäß zusammengeführt und die DNA vollautomatisch in einem Thermocycler amplifiziert werden kann. Die PCR-Effizienz bzw. Sensitivität dieses Systems zeigt sich schon bei der Durchführung von 25 PCR-Zyklen, da aus einem Zielmolekül bereits 3,2×107 Kopien synthetisiert werden.

Anmerkungen

Die Quelle der wörtlichen Übernahmen ist nicht angegeben.

Sichter
(Graf Isolan), fret

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