von Dr. Sandro Lorenz
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| [1.] Slo/Fragment 050 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-17 20:37:09 WiseWoman | Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schurek 2007, Schutzlevel sysop, Slo |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 50, Zeilen: 1-4, 9-24 |
Quelle: Schurek 2007 Seite(n): 34, 35, Zeilen: 34: letzte Zeile - 35: 1ff |
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| [Die] Plasmidpräparation erfolgt nach Angaben des Herstellers (Wizard® Plus SV Minipreps, Promega). Die aufgereinigten Plasmide werden einer Restriktionsanalyse unterzogen. Zeigen die DNA-Fragmente die erwarteten Größen, schließt sich eine Sequenzierung dieser positiven Klone an.
[...] 3.1.9 Plasmidpräparation mit STET-Puffer Neben den kommerziellen Reaktionspaketen (Kits) bieten sich so genannte „Quick and Dirty“-Methoden an, um den Erfolg einer Klonierung im größeren Maßstab kostengünstig zu untersuchen. Dabei werden die Bakterienzellen analog zu den Reagenzien eines Kits zunächst lysiert. Es folgt eine alkoholische Fällung der Plasmid- DNA, die anschließend in einem basischen Puffer gelöst und durch Restriktionsanalyse untersucht wird. Von 5 ml O/N Kulturen wird pro Ansatz ca. 1 ml in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt und für 30 Sek bei 10 000 rpm zentrifugiert. Das entstandene Pellet wird in 480 μl STET-Puffer mit 20 μl Lysozym (10 mg/ml) resuspendiert und für 5 Min bei RT inkubiert. Anschließend wird für 5 Min bei 95 °C inkubiert und für 15 Min bei RT und 14 000 rpm zentrifugiert. Das entstandene Pellet wird entfernt und der Überstand mit 500 μl Isopropanol versetzt und vermischt. Nach einer Zentrifugation für 15 Min bei RT und 14 000 rpm wird der Überstand entfernt und das entstandene Pellet in 50 μl 10 mM Tris/HCl pH 8 resuspendiert. Zu dem folgenden Restriktionsverdau wird zusätzlich 100 μg/ml RNase A gegeben. |
Die Plasmidpräparation erfolgt nach Angaben des
[Seite 35] Herstellers (Wizard® Plus SV Minipreps, Promega). Die aufgereinigten Plasmide werden einer Restriktionsanalyse unterzogen. Zeigen die DNA-Fragmente die erwarteten Größen, schließt sich eine Sequenzierung (Tab.3.1 PCR-Bedingungen) dieser positiven Klone an. 3.1.11 Plasmidpräparation mit STET-Puffer Neben den kommerziellen Reaktionspaketen (Kits) bieten sich so genannte „Quick and Dirty“-Methoden an, um den Erfolg einer Klonierung im größeren Maßstab kostengünstig zu untersuchen. Dabei werden die Bakterienzellen analog zu den Reagenzien eines Kits zunächst lysiert. Es folgt eine alkoholische Fällung der Plasmid-DNA, die anschließend in einem basischen Puffer gelöst und durch Restriktionsanalyse untersucht wird. Von 5 ml O/N Kulturen wird pro Ansatz ca. 1 ml in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt und für 30 Sek bei 10.000 rpm zentrifugiert. Das entstandene Pellet wird in 480 μl STET-Puffer mit 20 μl Lysozym (10 mg/ml) resuspendiert und für 5 Min bei RT inkubiert. Anschließend wird für 5 Min bei 95°C inkubiert und für 15 Min bei RT und 14.000 rpm zentrifugiert. Das entstandene Pellet wird entfernt und der Überstand mit 500 μl Isopropanol versetzt und vermischt. Nach einer Zentrifugation für 15 Min bei RT und 14.000 rpm wird der Überstand entfernt und das entstandene Pellet in 50 μl 10 mM Tris/HCl pH 8 resuspendiert. Zu dem folgenden Restriktionsverdau wird zusätzlich 100 μg/ml RNase A gegeben. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [2.] Slo/Fragment 050 05 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-17 20:36:43 WiseWoman | Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Schäfer 2004, Slo |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 50, Zeilen: 5-8 |
Quelle: Schäfer_2004 Seite(n): 73, Zeilen: 3-6 |
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| 3.1.8 Plasmidpräparation über Ionenaustauschersäulen
Zur Isolierung hochreiner Plasmid-DNA für Sequenzierungen oder Transfektionen wurden käuflich erworbene Maxi-, Midi- und Minipräparations-„Kits“ der Firmen Macherey-Nagel oder Qiagen bezogen und nach Herstellerangaben verwendet. |
6.1.14 Plasmidpräparation über Ionenaustauschersäulen
Zur Isolierung hochreiner Plasmid-DNA für Sequenzierungen oder Transfektionen wurden käuflich erworbene Maxi-, Midi- und Minipräparations-„Kits“ der Firmen Macherey-Nagel oder Qiagen bezogen und nach Herstellerangaben verwendet. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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| [3.] Slo/Fragment 050 25 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-17 20:36:15 WiseWoman | Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Schäfer 2004, Slo |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 50, Zeilen: 25-29 |
Quelle: Schäfer_2004 Seite(n): 73, Zeilen: 7-12 |
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| 3.1.10 Fällen von DNA
Die zu fällende DNA wird vorgelegt und, falls nötig, mit Wasser auf mindestens 50 μl aufgefüllt. Zur Präzipitation wird die Lösung mit 1/10 Volumen 3 M NaOAc/HOAc pH = 4.7 und 2.5 x Volumen kaltem 100 % Ethanol versetzt. Die Mischung wird zunächst für 1 h bei –70 °C inkubiert und anschließend für mindestens 30 Min bei 14000 rpm [und 4 °C zentrifugiert.] |
6.1.15 Fällen von DNA
Die zu fällende DNA wird vorgelegt und, falls nötig, mit Wasser auf mindestens 50 μl aufgefüllt. Zur Präzipitation wird die Lösung mit 1/10 Volumen 3 M M NaOAc/HOAc pH = 4.7 und 2.5 x Volumen kaltem 100 % Ethanol versetzt. Die Mischung wird zunächst für 1 h bei –70 °C inkubiert und anschließend für mindestens 30 Min bei 14000 rpm und 4 °C zentrifugiert. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. Fortsetzung auf der nächsten Seite. |
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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Hindemith, Zeitstempel: 20140519172436