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Über die Interaktion der humanen Ionenkanäle TRPC3 und TRPC6 mit dem Multi-PDZ-Domänen Protein PATJ im menschlichen Podozyten

von Dr. Sandro Lorenz

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Slo/Fragment 051 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-17 20:30:56 WiseWoman
Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Schäfer 2004, Slo

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 51, Zeilen: 1-4
Quelle: Schäfer 2004
Seite(n): 73, Zeilen: 12-15
Die ausgefallene DNA wird zweimal mit kaltem 70 % Ethanol gewaschen und im Vakuum für 5 – 10 Min getrocknet. Bei Bedarf wird die DNA schließlich in dem gewünschten Puffer durch Inkubation für 10 – 15 Min bei 65 °C gelöst oder zur Sequenzierung an MWG BIOTECH geschickt. Die ausgefallene DNA wird zweimal mit kaltem 70 % Ethanol gewaschen und im Vakuum für 5 – 10 Min getrocknet. Bei Bedarf wird die DNA schließlich in dem gewünschten Puffer durch Inkubation für 10 – 15 Min bei 65 °C gelöst oder zur Sequenzierung an MWG BIOTECH geschickt.
Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Die Übernahme beginnt auf der Vorseite: Slo/Fragment 050 25.

Sichter
(Hindemith) Schumann

[2.] Slo/Fragment 051 05 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-17 20:31:35 WiseWoman
Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schurek 2007, Schutzlevel sysop, Slo

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 51, Zeilen: 5-27
Quelle: Schurek 2007
Seite(n): 35, 36, Zeilen: 35: 18ff - 36: 1ff
3.2 Proteinbiochemische Methoden

3.2.1 Proteinexpression und Proteingewinnung im prokaryoten System

Das bakterielle Expressionssystem bietet den Vorteil, in kurzer Zeit große Proteinmengen gewinnen zu können. Bakterien sind jedoch nur in der Lage, Proteine bis zu einem Molekulargewicht von ca. 70 kD zu exprimieren, ohne dass es zu Degradationen dieses Proteins kommt.

3.2.1.1 GST-pulldown

Der GST-pulldown ist eine biochemische in vitro Methode die sich eignet, um Protein- Protein-Interaktionen zu untersuchen. Dazu wird ein rekombinantes GST-Fusionsprotein im bakteriellen Expressionssystem hergestellt und an Glutathion- Sepharose (GS-beads) immobilisiert. Es folgt die Inkubation dieses Fusionsproteins mit einem Zellysat, das den potentiellen Interaktionspartner enthält. Der Nachweis dieser potentiellen Interaktion wird durch Western Blot Analyse ermittelt.

Die Expression des rekombinanten GST-Fusionsproteins erfolgt durch das pGex- Vektorsystem. Dieser bakterielle Expressionsvektor enthält das Gen Glutathion-S-Transferase (GST), hinter welches das gewünschte Gen kloniert wird. Die Proteinexpression resultiert in einem Fusionsprotein, das mit hoher Affinität an Glutathion bindet. Im Versuch wird diese Affinität genutzt, um das Fusionsprotein an einer Glutathion-Sepharose-Matrix zu immobilisieren und dadurch von den endogenen bakteriellen Proteinen zu trennen.

3.2.1.2 Herstellung rekombinanter GST-Fusionsproteine

Der E. coli-Stamm BL21 wird mit 100 ng Plasmid-DNA transformiert. Von den gewachsenen Kolonien wird ein Klon in 50 ml LB-Medium mit entsprechendem [Antibiotikum vorkultiviert und zum Animpfen einer 1 l Hauptkultur benutzt.]

3.2 Proteinbiochemische Methoden

3.2.1 Proteinexpression und Proteingewinnung im prokaryoten System

Das bakterielle Expressionssystem bietet den Vorteil, in kurzer Zeit große Proteinmengen gewinnen zu können. Bakterien sind jedoch nur in der Lage, Proteine bis zu einem Molekulargewicht von ca. 70 kD zu exprimieren, ohne dass es zu Degradationen dieses Proteins kommt.

3.2.1.1 GST-pulldown

Der GST-pulldown ist eine biochemische in vitro Methode, die sich eignet, um Protein- Protein-Interaktionen zu untersuchen. Dazu wird ein rekombinantes GST-Fusionsprotein im bakteriellen Expressionssystem hergestellt und an Glutathion-Sepharose (GS-beads) immobilisiert. Es folgt die Inkubation dieses Fusionsproteins mit einem Zellysat, das den

[Seite 36]

potentiellen Interaktionspartner enthält. Der Nachweis dieser potentiellen Interaktion wird durch Western Blot Analyse ermittelt.

Die Expression des rekombinanten GST-Fusionsproteins erfolgt durch das pGex- Vektorsystem. Dieser bakterielle Expressionsvektor enthält das Gen Glutathion-S-Transferase (GST), hinter welches das gewünschte Gen kloniert wird [28]. Die Proteinexpression resultiert in einem Fusionsprotein, das mit hoher Affinität an Glutathion bindet. Im Versuch wird diese Affinität genutzt, um das Fusionsprotein an einer Glutathion-Sepharose-Matrix zu immobilisieren und dadurch von den endogenen bakteriellen Proteinen zu trennen.

3.2.1.2 Herstellung rekombinanter GST-Fusionsproteine

Der E. coli-Stamm BL21 wird mit 100 ng Plasmid-DNA transformiert (Vgl. 3.3.3.2). Von den gewachsenen Kolonien wird ein Klon in 50 ml LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum vorkultiviert und zum Animpfen einer 1 l Hauptkultur benutzt.


28. Guan KL, Dixon JE: Eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli: an improved thrombin cleavage and purification procedure of fusion proteins with glutathione Stransferase. Anal Biochem 1991;192:262-267.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith) Schumann


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Hindemith, Zeitstempel: 20140519172520

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