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Über die Interaktion der humanen Ionenkanäle TRPC3 und TRPC6 mit dem Multi-PDZ-Domänen Protein PATJ im menschlichen Podozyten

von Dr. Sandro Lorenz

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Slo/Fragment 060 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-17 20:23:11 WiseWoman
Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schurek 2007, Schutzlevel sysop, Slo

Typus
KomplettPlagiat
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 60, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Schurek 2007
Seite(n): 41, 42, Zeilen: 41: letzte vier Zeilen - 42: 1ff
Dazu wird das Medium abgenommen und die Zellen werden einmal gewaschen, indem pro 10 cm Kulturschale ca. 10 ml vorgewärmtes 1x PBS vorsichtig in die Kulturschale gegeben wird. Es folgt eine Inkubation mit 1 ml Trypsin/EDTA pro 10 cm Kulturschale für 2-3 Min bei 37 °C. Nachdem sich die Zellen abgelöst haben, wird die Wirkung des Trypsins durch Zugabe von 9 ml vorgewärmten Mediums neutralisiert. Die Zellen werden resuspendiert und auf neue Kulturschalen verteilt, in denen ein entsprechendes Volumen vorgewärmten Mediums vorgelegt wurde. Die immortalisierten Podozytenzelllinien wurden mit einem temperatursensitiven Large T-Antigen transformiert, wodurch die Proliferation dieser Zellen ausschließlich auf die Kultivierung bei 33 °C beschränkt ist. Aus diesem Grund werden nur bei 33 °C kultivierte Podozyten geteilt. Zur Differenzierung werden die Podozyten für 10-14 Tage bei 37 °C (humane Podozyten) bzw. 38 °C (murine Podozyten) kultiviert. Die Kultivierung und Passagierung der HEK 293T Zellen erfolgt bei 37 °C.

3.3.1.4 Einfrieren eukaryoter Zellen

Die dauerhafte Lagerung eukaryoter Zellen erfolgt in Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff. Für das Einfrieren werden ca. 107 Zellen nach einmaligem Waschen mit 1 x PBS wie beschrieben abgelöst und in dem entsprechenden Kulturmedium resuspendiert. Es folgt eine Zentrifugation für 5 Min bei 1 000 rpm bei 4 °C. Das Zellpellet wird in 1 ml kaltes Medium mit 10 % (v/v) DMSO resuspendiert und in Kryoröhrchen überführt. Die Lagerung erfolgt zunächst für 24 h bei -20 °C, um das langsame Einfrieren der Zellen zu gewährleisten. Anschließend werden die Zellen für weitere 24 h in -80 °C transferiert. Für die dauerhafte Konservierung werden die Zellen in flüssigen Stickstoff überführt.

3.3.1.5 Auftauen eukaryoter Zellen

Die Zellen werden bei 37 °C schnell aufgetaut, in vorgewärmtes Medium überführt und für 5 Min bei 1000 rpm bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das entstandene Zellpellet in entsprechendem Medium resuspendiert, in eine Zellkulturschale überführt und bei 33 °C (Podozyten) bzw. 37 °C (HEK 293T) in Kultur genommen.

Dazu wird das Medium abgenommen und die Zellen werden gewaschen, indem pro 10 cm Kulturschale ca. 10 ml vorgewärmtes 1 x PBS vorsichtig in die Kulturschale gegeben wird. Es folgt eine Inkubation mit 1 ml Trypsin/EDTA pro 10 cm Kulturschale für 2 - 3 Min bei 37°C. Nachdem sich die

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Zellen abgelöst haben, wird die Wirkung des Trypsins durch Zugabe von 9 ml vorgewärmten Mediums neutralisiert. Die Zellen werden resuspendiert und auf neue Kulturschalen verteilt, in denen ein entsprechendes Volumen vorgewärmten Mediums vorgelegt wurde. Die immortalisierten Podozytenzellinien wurden mit einem temperatursensitiven Large T-Antigen transformiert, wodurch die Proliferation dieser Zellen ausschließlich auf die Kultivierung bei 33°C beschränkt ist. Aus diesem Grund werden nur bei 33°C kultivierte Podozyten geteilt. Zur Differenzierung werden die Podozyten für 10 - 14 Tage bei 37°C (Humane Podozyten) bzw. 38°C (Murine Podozyten) kultiviert. Die Kultivierung und Passagierung der HEK 293T Zellen erfolgt bei 37°C.

3.3.1.4 Einfrieren eukaryoter Zellen

Die dauerhafte Lagerung eukaryoter Zellen erfolgt in Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff. Für das Einfrieren werden ca. 106 Zellen nach einmaligem Waschen mit 1 x PBS wie beschrieben trypsiniert und in dem entsprechenden Kulturmedium resuspendiert. Es folgt eine Zentrifugation für 5 Min bei 1.000 rpm bei RT. Das Zellpellet wird in 1 ml FCS mit 10 % (v/v) DMSO resuspendiert und in Kryoröhrchen überführt. Die Lagerung erfolgt zunächst für 24 h bei -20°C, um das langsame Einfrieren der Zellen zu gewährleisten. Anschließend werden die Zellen für weitere 24 h in -80°C transferiert. Für die dauerhafte Konservierung werden die Zellen in flüssigen Stickstoff überführt.

3.3.1.5 Auftauen eukaryoter Zellen

Die Zellen werden bei RT aufgetaut, in vorgewärmtes Medium überführt und für 5 Min bei 1.000 rpm bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das entstandene Zellpellet in entsprechendem Medium resuspendiert, in eine Zellkulturschale überführt und bei 33°C (Podozyten) bzw. 37°C (HEK 293T) in Kultur genommen.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith) Schumann


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Hindemith, Zeitstempel: 20140519173036

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