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Slo/062

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Über die Interaktion der humanen Ionenkanäle TRPC3 und TRPC6 mit dem Multi-PDZ-Domänen Protein PATJ im menschlichen Podozyten

von Dr. Sandro Lorenz

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Slo/Fragment 062 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-17 20:19:44 WiseWoman
Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schurek 2007, Schutzlevel sysop, Slo, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 62, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Schurek 2007
Seite(n): 43, 44, Zeilen: 43: 20ff
[Es] folgt eine Inkubation bei 250 rpm und 30 °C bis eine OD600nm von 0.6-0.8 erreicht ist. Die Hefezellen werden bei RT für 3 Min und 2000 rpm zentrifugiert und das entstandene Pellet in sterilem H2O resuspendiert. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt bei gleichen Bedingungen wird das Pellet in 3-5 ml 50 % (w/v) PEG 4000 resuspendiert. Die kompetenten Hefezellen sollten innerhalb der nächsten Stunde transformiert werden, um eine hohe Effizienz zu erzielen.

3.3.2.2 Transformation von Hefen

Für einen 30 μl Transformationsansatz werden 100 ng pro Plasmid-DNA eingesetzt. Zu diesem Ansatz werden 720 μl der kompetenten Hefezellsuspension, 108 μl 1 M Lithiumacetat und 135 μl H2O gegeben. Nach guter Durchmischung folgt eine Inkubation von 30 Min bei 30 °C und 250 rpm. Im Anschluss daran werden die Hefezellen für 30 Min einem Hitzeschock bei 42 °C ausgesetzt, 5 Min auf Eis inkubiert und für 3 Min bei RT und 2000 rpm zentrifugiert. Das entstandene Pellet wird in 100 μl H2O resuspendiert und auf entsprechenden SD-Selektionsplatten ausgestrichen. Die Platten werden für 2-4 Tage im Brutschrank bei 30 °C inkubiert.

3.3.2.3 β-Galaktosidase Filter Assay

Der β-Galaktosidase Assay beruht auf der Expression des Reportergens lacZ, das für β-Galaktosidase kodiert, welche die Hydrolyse von X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galaktopyranosid) zu einem blauen Indigo-Farbstoff katalysieren kann. Für die Durchführung des β-Gal-Assays werden je Ansatz zwei Filterpapiere vorbereitet, die einen geringfügig kleineren Durchmesser aufweisen als die SD-Selektionsplatten, auf denen die zu testenden Hefen wachsen. Pro Ansatz wird je ein Filterpapier in einem geeigneten Gefäß mit X-Gal-Gebrauchslösung inkubiert. Für ein Ø 10 cm Gefäß sind 2.5 ml der X-Gal-Gebrauchslösung ausreichend. Das zweite Filterpapier wird direkt auf die Hefekolonien gelegt und gleichmäßig angedrückt. Sobald sich ein Abdruck der Hefekolonien auf dem Filterpapier zeigt, wird dieses für 10 Sek. in flüssigen Stickstoff eingetaucht, um die Hefezellen aufzubrechen. Das gefrorene Filterpapier wird bei RT aufgetaut und mit der Seite des Hefe-Abdrucks auf das in X-Gal-Lösung getränkte Filterpapier gelegt. Wenn nach 2-3 h eine Blaufärbung optisch einwandfrei zu erkennen ist, enthalten die Zellen zwei interagierende Proteine.

Es folgt eine Inkubation bei 250 rpm und 30°C bis eine OD600nm von 0.6 - 0.8 erreicht ist. Die Hefezellen werden bei RT für 3 Min und 2000 rpm zentrifugiert und das entstandene Pellet in sterilem H2O resuspendiert. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt bei gleichen Bedingungen wird das Pellet in 3 - 5 ml 50 % (w/v) PEG 4000 resuspendiert. Die kompetenten Hefezellen sollten innerhalb der nächsten Stunde transformiert werden, um eine hohe Effizienz zu erzielen.

3.3.2.2 Transformation von Hefen

Für einen 30 μl Transformationsansatz werden 100 ng pro Plasmid-DNA eingesetzt. Zu diesem Ansatz werden 720 μl der kompetenten Hefezellsuspension, 108 μl 1 M Lithiumacetat und 135 μl H2O gegeben. Nach guter Durchmischung folgt eine Inkubation von 30 Min bei 30°C und 250 rpm. Im Anschluss daran werden die Hefezellen für 30 Min einem Hitzeschock bei 42°C ausgesetzt, 5 Min auf Eis inkubiert und für 3 Min bei RT und 2.000 rpm

[Seite 44]

zentrifugiert. Das entstandene Pellet wird in 100 μl H2O resuspendiert und auf entsprechenden SD-Selektionsplatten (Vgl. Material 2.4.2.2) ausgestrichen. Die Platten werden für 2 - 4 Tage im Brutschrank bei 30°C inkubiert.

3.3.2.3 β-Galaktosidase Filter Assay (β-Gal-Assay)

Der β-Galaktosidase Assay beruht auf der Expression des Reportergens lacZ, das für β-Galaktosidase kodiert, welche die Hydrolyse von X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galaktopyranosid) zu einem blauen Indigo-Farbstoff katalysiert. Für die Durchführung des β-Gal-Assays werden je Ansatz zwei Filterpapiere vorbereitet, die einen geringfügig kleineren Durchmesser aufweisen als die SD-Selektionsplatten, auf denen die zu testenden Hefen wachsen. Unter einem Laborabzug wird pro Ansatz je ein Filterpapier in einem geeigneten Gefäß mit X-Gal-Gebrauchslösung inkubiert. Für ein Ø 10 cm Gefäß sind 2.5 ml der X-Gal-Gebrauchslösung ausreichend. Das zweite Filterpapier wird direkt auf die Hefekolonien gelegt und gleichmäßig angedrückt. Sobald sich ein Abdruck der Hefekolonien auf dem Filterpapier zeigt, wird dieses unter zu Hilfenahme einer Pinzette für 10 Sek. in flüssigen Stickstoff eingetaucht. Das gefrorene Filterpapier wird bei RT aufgetaut und mit der Seite des Hefe-Abdrucks auf das in X-Gal-Lösung getränkte Filterpapier gelegt. Nach 2 - 3 h sollte eine Blaufärbung optisch einwandfrei zu erkennen sein.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith) Schumann


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Hindemith, Zeitstempel: 20140519173107

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