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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 61, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Schurek 2007
Seite(n): 42, 43, Zeilen: 42: 24ff; 43: 1ff
3.3.2 Das Yeast Two-Hybrid System

Das von Fields und Song entwickelte Yeast Two-Hybrid (Y2H) System dient der Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen. Es handelt sich dabei um ein in vivo Modell, bei dem in der Hefe ein bekanntes Protein als Köder (bait) eingesetzt wird, um neue Interaktionspartner zu identifizieren. Als potentielle Beute (prey) kann eine Genbank (cDNA library) oder ein anderes bekanntes Protein angeboten werden, die in ihrer Proteinexpression auf spezifische Gewebe oder Zelltypen beschränkt sein kann. Die Methode beruht auf dem modularen Aufbau des endogenen Transkriptionsaktivators GAL 4 der Hefe. Dieser setzt sich aus einer DNA bindenden (DB) und einer DNA aktivierenden (DA) Domäne zusammen. Die räumliche Nähe dieser beiden Domänen führt zu einer Bindung und anschließenden Aktivierung der Reportergene lacZ und His3, die unter der Kontrolle von GAL4 stehen. Für den Yeast Two-Hybrid Screen werden diese beiden Domänen getrennt und durch verschiedene Vektoren exprimiert, wobei das bait zusammen mit der DB exprimiert wird. Die prey-Vektoren exprimieren zufällige Fusionsproteine aus der Genbank und der DNA aktivierenden Domäne. Die bait-Vektoren kodieren zusätzlich für ein Enzym des Leucin Anabolismus, die prey-Vektoren für eine Tryptophan-Auxotrophie. Die Transformation dieser Vektoren in Hefezellen ermöglicht ein Wachstum auf Selektionsmedium, das kein Leucin und/oder Tryptophan enthält (SD-L-T). Einige Hefestämme wachsen trotz Mutation im His3-Gen in geringem Maße auf histidindefizientem Medium. Aus diesem Grund wird Medium ohne Histidin (SD-L-TH) mit dem kompetitiven Inhibitor dieses Genprodukts, 3-Amino-1, 2, 4-triazol (3-AT), ergänzt, indem 25-50 mM 3-AT zugegeben werden. Wachsen die ko-transformierten GAL 4-defizienten kompetenten Hefezellen auch auf SD-L-T-H + 3-AT Agarplatten, kann ein so genannter β-Galaktosidase Filter Assay durchgeführt werden. Die Hefekolonien, die in diesem Assay eine Blaufärbung zeigen, exprimieren das Reportergen, was als Hinweis für eine Protein-Protein-Interaktion gedeutet werden kann.

3.3.2.1 Herstellung kompetenter Hefezellen

Ein Volumen von 50 ml YPAD-Medium wird mit einer O/N Flüssigkultur des zu transformierenden Hefestammes angeimpft und auf eine OD600nm von 0.2 eingestellt.

3.3.2 Das Yeast Two-Hybrid System

Das von Fields und Song entwickelte Yeast Two-Hybrid (Y2H) System dient der Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen [23]. Es handelt sich dabei um ein in vivo Modell, bei dem in einem Hefesystem ein bekanntes Protein als Köder (bait) eingesetzt wird, um neue Interaktionspartner zu identifizieren. Als potentielle Beute (prey) wird eine Genbank (cDNA library) angeboten, die in ihrer Proteinexpression auf spezifische Gewebe oder Zelltypen beschränkt sein kann. Die Methode beruht auf dem modularen Aufbau des endogenen Transkriptionsaktivators GAL 4 der Hefe. Dieser setzt sich aus einer DNA

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bindenden (DB) und einer DNA aktivierenden (DA) Domäne zusammen. Die räumliche Nähe dieser beiden Domänen führt zu einer Bindung und anschließenden Aktivierung der Reportergene lacZ und His3, die unter der Kontrolle von GAL 4 stehen. Für den Yeast Two- Hybrid Screen werden diese beiden Domänen getrennt und auf verschiedenen Vektoren exprimiert, wobei das bait zusammen mit der DB exprimiert wird. Die prey-Vektoren exprimieren zufällige Fusionsproteine aus der Genbank und der DNA aktivierenden Domäne. Die bait-Vektoren kodieren zusätzlich für eine Leucin-Auxotrophie, die prey-Vektoren für eine Tryptophan-Auxotrophie. Die Transformation dieser Vektoren in Hefezellen ermöglicht ein Wachstum auf Selektionsmedium, das kein Leucin und Tryptophan enthält (SD-L-T). Einige Hefestämme wachsen trotz Mutation im His3-Gen in geringem Maße auf histidindefizientem Medium. Aus diesem Grund wird Medium ohne Histidin (SD-L-T-H) mit dem kompetetiven Inhibitor dieses Genprodukts, 3-Amino-1, 2, 4-triazol (3-AT), ergänzt, indem 25 - 50 mM 3-AT zugegeben werden. Wachsen die ko-transformierten GAL 4- defizienten kompetenten Hefezellen auch auf SD-L-T-H + 3-AT Agarplatten, kann ein so genannter β-Galaktosidase Filter Assay durchgeführt werden. Die Hefekolonien, die in diesem Assay eine Blaufärbung zeigen, exprimieren das Reportergen, was als Hinweis für eine Protein-Protein-Interaktion gedeutet werden kann.

3.3.2.1 Herstellung kompetenter Hefezellen

Ein Volumen von 50 ml YPAD-Medium wird mit einer O/N Flüssigkultur des zu transformierenden Hefestammes angeimpft und auf eine OD600nm von 0.2 eingestellt.


23. Fields S, Song O: A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 1989;340:245-246.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith) Schumann

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