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Uta/036

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Stickstoffmonoxid-mediierter Stress auf Inselzellen des Rattenpankreas: Effekte auf die Zink-Homöostase, den Glutathion-Gehalt und das mitochondriale Membranpotential

von Dr. Ulrike Tartler

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Uta/Fragment 036 01 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-01-04 23:06:49 Graf Isolan
Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Uta, Verschleierung, Voß 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 36, Zeilen: 1-15
Quelle: Voß 2004
Seite(n): 35-36, Zeilen: 35:24.27-36 - 36.1-3
Versuchsdurchführung:

Unmittelbar vor jeder Messung wird eine Standardeichreihe mit NaNO2 in Aqua bidest in den Konzentrationen 0 nM, 0,25 nM, 0,5 nM, 1 nM, 2,5 nM, 5 nM und 10 nM angesetzt, die bei jeder Nitritbestimmung doppelt mitgeführt wird.

Aus jedem Kulturüberstand werden zwei 100 μl – Proben entnommen und zusammen mit 100 μl der Eichreihe und einem zweifachen Mediumreferenzwert, der aus 100 μl Medium ohne Zellen, das über den jeweiligen Versuchszeitraum mitinkubiert wurde, besteht, auf eine 96-well ELISA-Platte gebracht. Für den Testansatz gibt man zu jeder 100 μl Probe 50 μl der Griess Reagenz I – Lösung und inkubiert nach Zugabe von 10 μl 37%iger HCl 10 min lang bei Raumtemperatur. Anschließend kommen 50 μl Griess Reagenz II-Lösung hinzu. Die rötliche Farbentwicklung kann dann bei 540 nm durch Absorption im ELISA-Photometer quantifiziert und nach Abzug des Extinktionswertes der Mediumkontrolle (Medium ohne Zellen bei gleicher Inkubation) mit der NaNO2–Konzentrationsreihe verglichen werden.

[Seite 35]

Durchführung:

[...]

Unmittelbar vor jeder Messung wird eine Standardeichreihe mit NaNO2 in Aqua bidest in den Konzentrationen 0 μM, 2,5 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM und 100 μM angesetzt, die bei jeder Nitritbestimmung doppelt mitgeführt wird.

Aus jedem Kulturüberstand werden zwei 100 μl – Proben entnommen und zusammen mit 100 μl der Eichreihe und einem zweifachen Mediumreferenzwert, der aus 100 μl Medium ohne Zellen, das über den jeweiligen Versuchszeitraum mitinkubiert wurde, besteht, auf eine 96-well Elisaplatte gebracht. Für den Testansatz gibt man zu jeder 100 μl Probe 50 μl der Griess Reagenz I – Lösung. Nach einer Inkubationszeit von fünf Minuten bei Raumtemperatur kommen 50 μl Griess Reagenz II-Lösung hinzu.

[Seite 36]

Die rötliche Farbentwicklung kann dann bei 540 nm durch Absorption im Elisaphotometer quantifiziert und nach Abzug des Extinktionswertes der Mediumkontrolle mit der NaNO2 – Konzentrationsreihe verglichen werden.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan) Schumann

[2.] Uta/Fragment 036 20 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-01-04 23:08:08 Graf Isolan
Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Uta, Verschleierung, Voß 2004

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Graf Isolan
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 36, Zeilen: 20-31
Quelle: Voß 2004
Seite(n): 36, Zeilen: 4-10, 20-26
2.2.21 Fluoreszenzfärbung mit dem Hoechst-Reagenz

Der Farbstoff bis-benzimidazole (Hoechst 33342) diffundiert durch die intakte Zellmembran lebender Zellen, bindet von außen an AT-reiche Regionen in der kleineren Furche der DNA und färbt so das Chromatin der Kerne der behandelten Zellen (Belloc et al., 1994). Inselzellen zeigen unter dem Fluoreszenzmikroskop eine hell-blaue Fluoreszenz der Kerne, die im Falle nekrotischer Zellen einen leuchtend tiefblauen Charakter annimmt.

Unmittelbar vor der Auswertung unter dem Fluoreszenzmikroskop werden 5 μl/ml Hoechst-Reagenz (9 mM) in den Zellüberstand pipettiert und durch leichtes Schwenken der Kulturplatte gleichmäßig verteilt. Zur Visualisierung des Hoechst-Farbstoffes wird ein Filter für blaue Fluoreszenz verwendet (Extinktion: 355 nm, Emission: 465 nm), zur Anwendung.

2.2.9 FLUORESZENZFÄRBUNG MIT HOECHST – REAGENZ UND ACRIDINORANGE

Der Farbstoff bis-benzimidazole (Hoechst 33342) diffundiert durch die intakte Zellmembran lebender Zellen, bindet von außen an AT-reiche Regionen in der kleineren Furche der DNA und färbt so das Chromatin der Kerne der behandelten Zellen. Unfixierte Zellen zeigen unter UV-Licht eine blaue Fluoreszenz der Kerne, die im Falle apoptotischer Zellen einen leuchtend hellen Charakter annimt [sic].

[...]

Unmittelbar vor der Auswertung unter dem Fluoreszenzmikroskop werden 5 μl/ml Hoechst – Reagenz (9 mM) oder alternativ 3μl/ml 3,3 mM Acridinorange in Ethanol (Endkonzentration: 10 μM) in den Zellüberstand pipettiert und durch leichtes Schwenken der Kulturplatte gleichmäßig verteilt. Zur Visualisierung des Hoechst-Farbstoffes wird ein Filter für blaue Fluoreszenz verwendet (Extinktion: 355 nm, Emsission [sic]: 465 nm), bei Acridinorange kommt ein Filter für grüne Fluoreszenz zur Anwendung.

Anmerkungen

Ohne Hinweis auf eine Übernahme.

Sichter
(Graf Isolan) Schumann


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Graf Isolan, Zeitstempel: 20140104230949

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