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Ves/084

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Genetische und immunologische Untersuchungen bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

von Dr. Veronika Schachinger

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Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
[1.] Ves/Fragment 084 03 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-06-21 09:05:35 Hindemith
Fragment, Gesichtet, Mauermann 2004, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Ves

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 84, Zeilen: 3-30
Quelle: Mauermann 2004
Seite(n): 39, 40, Zeilen: 39: 1 ff.; 40: 1 f.
3.2.5. Polymerasekettenreaktion (PCR)

Mit Hilfe der PCR kann eine bestimmte Zielsequenz einer komplexen genomischen DNA oder bei der RT-PCR eine bestimmte cDNA selektiv exponentiell amplifiziert werden. Die Methode besitzt eine hohe Sensitivität, es reichen wenige Kopien der Zielsequenz als Vorlage aus. Zusätzlich weist sie eine hohe Spezifität auf, eine selektive Amplifizierung einer einzelnen Sequenz unter Millionen verschiedener Sequenzen ist möglich. Dazu müssen sich zwei zu je einem der beiden Stränge des DNA-Doppelstrangs komplementär und mit ihren 3’-Enden aufeinander zu orientieren, etwa 15 – 25 Basen lange Oligonukleotide als Primer an die zuvor denaturierte DNA binden. Dadurch kann eine hitzestabile DNA-Polymerase den zwischen den Primern gelegenen Abschnitt amplifizieren. Zur Minimierung des Auftretens unspezifischer Amplifikate kann eine Taq-DNA-Polymerase verwendet werden, welche hitzelabile Schutzgruppen trägt und erst durch eine Erhitzung auf 95 °C aktiviert wird. Dieser zyklische Prozess aus Denaturierung, Primeranlagerung und Extension wurde so oft wiederholt, bis die Zielsequenz zum Nachweis ausreichend vervielfältigt war. Anfangs erfolgte eine einmalige Anfangsdenaturierung von 5 – 15 Minuten je nach verwendeter Taq- DNA-Polymerase. Danach folgt die beschriebene Amplifikation für 30- 40 Zyklen, bestehend aus Denaturierung bei 94 °C für 30 Sekunden, Primeranlagerung bei der für das betreffende Primerpaar optimalen Temperatur für ebenfalls 30 Sekunden, sowie die Extension bei 72 °C für eine von der Länge des Amplifikats abhängigen Dauer, mindestens jedoch 30 Sekunden. Der letzte Schritt ist die Endextension bei 72 °C für 10 Minuten, bei der alle noch nicht komplett amplifizierten PCR-Produkte vervollständigt werden sollen. Der PCR-Ansatz setzt sich zusammen aus einem PCR-Puffer, einem Mix aus den vier Desoxinukliotidtriphospaten (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), den beiden für die Zielsequenz spezifischen Oligonukleotid- Primern, Magnesiumchloridlösung zur Einstellung der durch Austestung ermittelten optimalen Mg2+-Konzentration, der Taq-DNA-Polymerase, destilliertem Wasser zur Einstellung des Gesamtvolumens, sowie der als Matrize dienenden Ausgangs-DNA. Bei jedem PCR-Ansatz wurde eine Negativkontrolle mit Wasser anstatt der Ausgangs-DNA mitgeführt.

6.2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Mit Hilfe der PCR kann eine bestimmte Zielsequenz einer komplexen genomischen DNA oder bei der RT-PCR eine bestimmte cDNA selektiv exponentiell amplifiziert werden. Die Methode besitzt eine hohe Sensitivität, es reichen wenige Kopien der Zielsequenz als Vorlage aus. Zusätzlich weist sie eine hohe Spezifität auf, eine selektive Amplifizierung einer einzelnen Sequenz unter Millionen verschiedener Sequenzen ist möglich. Dazu müssen sich zwei zu je einem der beiden Stränge des DNA-Doppelstrangs komplementäre und mit ihren 3’-Enden aufeinander zu orientierte, etwa 15–25 Basen lange Oligonukleotide als Primer an die zuvor denaturierte DNA binden. Dadurch kann eine hitzestabile DNA-Polymerase den zwischen den Primern gelegenen Abschnitt amplifizieren. Zur Minimierung des Auftretens unspezifischer Amplifikate kann eine Heißstart Taq-DNA-Polymerase verwendet werden, welche hitzelabile Schutzgruppen trägt und erst durch eine Erhitzung auf 95 °C aktiviert wird. Dieser zyklische Prozess aus Denaturierung, Primeranlagerung („Primer-Annealing“) und Extension wurde so oft wiederholt, bis die Zielsequenz zum Nachweis ausreichend vervielfältigt war. Anfangs erfolgte eine einmalige Anfangsdenaturierung von 5-15 Minuten je nach verwendeter Taq-DNA-Polymerase. Danach folgt die beschriebene Amplifikation 30-40 Zyklen bestehend aus Denaturierung bei 94 °C für 30 Sekunden, Primeranlagerung bei der für das betreffende Primerpaar optimalen Temperatur für ebenfalls 30 Sekunden sowie die Extension bei 72 °C für eine von der Länge des Amplifikats abhängigen Dauer, mindestens jedoch 30 Sekunden. Der letzte Schritt ist die Endextension bei 72 °C für 10 Minuten, bei der alle noch nicht komplett amplifizierten PCR-Produkten vervollständigt werden sollen. Der PCR-Ansatz setzt sich zusammen aus einem PCR-Puffer, einem Mix aus den vier Deoxinukleotidtriphosphaten (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), den beiden für die Zielsequenz spezifischen Oligonukleotid-Primern, Magnesiumchloridlösung zur Einstellung der durch Austestung ermittelten optimalen Mg2+-Konzentration, der Taq-DNA-Polymerase, destilliertem Wasser zur Einstellung des Gesamtvolumens sowie

[Seite 40]

der als Matrize dienenden Ausgangs-DNA. Bei jedem PCR-Ansatz wurde eine Negativkontrolle mit Wasser anstatt der Ausgangs-DNA mitgeführt.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith), SleepyHollow02


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Hindemith, Zeitstempel: 20140621090853

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