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Ves/Fragment 086 01

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Typus
Verschleierung
Bearbeiter
Hindemith
Gesichtet
Yes.png
Untersuchte Arbeit:
Seite: 86, Zeilen: 1 ff. (komplett)
Quelle: Mauermann 2004
Seite(n): 41, 42, Zeilen: 41: 17 ff.; 42: 1 ff.
3.2.7. Restriktions-Fragment-Längenpolymorphismus (RFLP)-Analyse

Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die von Bakterien synthetisiert werden und spezifisch DNA-Sequenzen erkennen und schneiden. Dabei wird zwischen Typ-I-, Typ-II- und Typ-III-Restriktionsendonukleasen unterschieden. Breite Anwendung finden vor allem die Typ-II-Restriktionsendonukleasen: Diese erkennen Palindrome und schneiden an genau definierten Positionen innerhalb der Erkennungssequenz. Palindrome sind in diesem Zusammenhang Sequenzen, welche mit ihrer Komplementärsequenz identisch sind. Liegt ein bestimmter Polymorphismus innerhalb einer Erkennungsstelle für ein bestimmtes Restriktionsenzym vor, so lässt er sich durch Restriktion (Verdau) eines PCR-Amplifikats nachweisen, welches die polymorphe Nukleotidposition beinhaltet. Ist keine komplette Erkennungsstelle vorhanden, kann durch eine in einzelnen Nukleotiden von der originalen Sequenz abweichende Primersequenz eine solche Erkennungsstelle in der PCR eingeführt werden. Voraussetzung dafür ist, dass in unmittelbarer Nachbarschaft der zu untersuchenden polymorphen Nukleotidposition eine zur Generierung einer Erkennungsstelle passende Sequenz vorliegt, die der Erkennungsstelle für ein bestimmtes Restriktionsenzym ausreichend ähnlich ist. Dabei muss die Nukleotidposition Teil der entsprechenden Erkennungsstelle sein (Erläuterung am Beispiel der 1007insC-Mutation des NOD2-Gens siehe unten). Der Ansatz für einen Restriktionsverdau beinhaltet einen bestimmten Puffer, das Restriktionsenzym sowie das zu verdauende PCR-Produkt. Es erfolgt eine Inkubation bei einer für jedes Enzym spezifischen Temperatur für mindestens zwei Stunden, meist jedoch über Nacht. Zur Visualisierung der entstandenen Restriktionsfragmente wird eine Agarosegelelektrophorese vorgenommen.

3.2.8. Genotypisierung des NOD2/CARD15-Gens in Bezug auf die 1007insC-Mutation

Ziel der Untersuchung ist der Nachweis der 1007insC-Mutation im NOD2/CARD15- Gen. Diese Mutation besteht aus der Insertion eines C/G-Basenpaares an der Nukleotidposition 1007. Verwendet wurde ein PCR mit RFLP-Analyse. Entsprechend der umliegenden Sequenz wurde als Restriktionsenzym Mwol ausgewählt, dessen Erkennungssequenz ein unterbrochenes Palindrom der Sequenz GCNNNNN/NNGC ist, dabei bedeutet N jede beliebige Base, der Schnitt erfolgt zwischen den Nukleotiden sieben und acht [der Erkennungssequenz.]

6.2.7 Restriktions-Fragment-Längenpolymorphismus (RFLP)-Analyse

Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die von Bakterien synthetisiert werden und spezifisch DNA-Sequenzen erkennen und schneiden. Dabei wird zwischen Typ-I-, Typ-II- und Typ-III-Restriktionsendonukleasen unterschieden. Breite Anwendung finden vor allem die Typ-II-Restriktionsendonukleasen. Diese erkennen Palindrome und schneiden an genau definierten Positionen innerhalb der Erkennungssequenz. Palindrome sind in diesem Zusammenhang Sequenzen, welche mit ihrer Komplementärsequenz identisch sind. Liegt ein bestimmter Polymorphismus innerhalb einer Erkennungsstelle für ein bestimmtes Restriktionsenzym, so lässt er sich durch Restriktion (Verdau) eines PCR-Amplifikats nachweisen, welches die polymorphe Nukleotidposition beinhaltet. Ist keine komplette Erkennungsstelle vorhanden, kann durch einen in einzelnen Nukleotiden von der originalen Sequenz abweichende Primersequenz eine solche Erkennungsstelle in der PCR eingeführt werden. Voraus-

[Seite 42]

setzung dafür ist, dass in unmittelbarer Nachbarschaft der zu untersuchenden polymorphen Nukleotidposition eine zur Generierung einer Erkennungsstelle passende Sequenz vorliegt, die der Erkennungsstelle für ein bestimmtes Restriktionsenzym ausreichend ähnlich ist. Dabei muss die Nukleotidposition Teil der entsprechenden Erkennungsstelle sein (Erläuterung am Beispiel der 3020insC-Mutation des NOD2-Gens s.u.). Der Ansatz für einen Restriktionsverdau beinhaltet einen bestimmten Puffer, das Restriktionsenzym sowie das zu verdauende PCR-Produkt. Es erfolgt eine Inkubation bei einer für jedes Enzym spezifischen Temperatur für mindestens zwei Stunden, meist jedoch über Nacht. Zur Visualisierung der entstandenen Restriktionsfragmente wird eine Agarosegelelektrophorese vorgenommen.

6.2.8 Genotypisierung des NOD2/CARD15-Gens in Bezug auf die 3020insC-Mutation

Ziel der Untersuchung war der Nachweis der 3020insC-Mutation im NOD2/ CARD15-Gen. Diese Mutation besteht aus der Insertion eines C/G-Basenpaares an der Nukleotidposition 3020. Verwendet wurde eine PCR mit RFLP-Analyse. Entsprechend der umliegenden Sequenz wurde als Restriktionsenzym MwoI (New England Biolabs, Beverly, MD, USA) ausgewählt, dessen Erkennungssequenz ein unterbrochenes Palindrom der Sequenz GCNNNNN/NNGC ist, dabei bedeutet N jede beliebige Base, der Schnitt erfolgt zwischen den Nukleotiden sieben und acht der Erkennungssequenz.

Anmerkungen

Ein Verweis auf die Quelle fehlt.

Sichter
(Hindemith), SleepyHollow02

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