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3 gesichtete Fragmente: "Verdächtig" oder "Keine Wertung"

[1.] Whs/Fragment 011 14 - Diskussion
Bearbeitet: 1. August 2017, 22:34 (Hindemith)
Erstellt: 14. February 2015, 07:15 SleepyHollow02
Fragment, Gesichtet, KeineWertung, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Whs

Typus
KeineWertung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes
Untersuchte Arbeit:
Seite: 11, Zeilen: 14 ff.
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 28, 30 f., Zeilen: 28: 13 ff.; 30: 28 ff.; 31: 1 ff.
Diese Untersuchungen folgten den Prinzipien der Helsinki-Deklaration zur Durchführung von klinischen Studien am Menschen unter ethischen Gesichtspunkten. Alle Teilnehmer unterschrieben vor Eintritt in die Studie eine Einverständniserklärung. Die lokale Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Marburg gab ihr Positivvotum. Eine weitere Lipid-senkende Therapie war ausgeschlossen. Die Probanden wurden gebeten, für die Dauer der Studie weder Ess- und Rauchgewohnheiten noch körperliche Aktivität zu ändern. Ausschlusskriterien waren kardiovaskuläre, thromboembolische und endokrinologische Erkrankungen in der Vorgeschichte und erhöhter Konsum von Alkohol oder Drogen sowie auch relevante Abweichungen klinisch-chemischer Laborparameter von Leber- und Nierenfunktion. 2.2 Probennahme und -asservierung Venöse Blutabnahmen wurden unmittelbar vor Studienbeginn als Basismessung sowie im Studienverlauf nach 6, 12 und 18 Wochen nach aufsteigender Dosierung der Medikation durchgeführt. Dazu mussten die Probanden nüchtern sein und eine wenigstens 10-stündige Rauch- sowie 24-stündige Alkoholkarenz einhalten. Die Blutentnahmen erfolgten dann zwischen 8 und 10 Uhr morgens nach einer wenigstens 20-minütigen Ruhepause kurz vor der Infusion einer 2H3-Leucin-Lösung. Die Proben wurden innerhalb einer Stunde nach Entnahme bei 3000g und 4°C für 30 Minuten zentrifugiert und nach Aufteilung in Aliquots (1 ml Eppendorfgefäße) in flüssigem Stickstoff schockgefroren bei -70°C bis zum Zeitpunkt der Analyse aufbewahrt. Da nach der Zentrifugation dem Serum kein Antioxidanz wie z. B. 3,5- [di-tert-Butyl-4-Hydroxy-Toluol (BHT; Merck, KGaA, Darmstadt) zugesetzt wurde, konnten wir nicht ausschließen, dass ein gewisser Anteil von Cholesterin bei der Probenasservierung und vor der Aufarbeitung bereits autoxidativ in 7α-Hydroxycholesterin umgewandelt wurde.] Diese Untersuchungen folgten den Prinzipien der Helsinki-Deklaration zur Durchführung von klinischen Studien am Menschen unter ethischen Gesichtspunkten. Alle Teilnehmer unterschrieben vor Eintritt in die Studie eine Einverständniserklärung. Die lokale Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Freien Universität Amsterdam gab ihr Positivvotum. Die Teilnehmerinnen waren zwischen 47 und 60 Jahre alt. Die letzte Menstruation war zwischen 6 und 24 Monaten vor Eintritt in die Studie, die FSH-Konzentration betrug über 30 IU/L und es bestanden bei keiner Teilnehmerin intolerable klimakterische Beschwerden. Der Body-Mass-Index lag zwischen 18 und 41.4 kg/m2 und der Gesamtcholesteringehalt im Serum war unter 300 mg/dL (8 mmol/L). Eine Lipid senkende Therapie war ausgeschlossen. Die Probandinnen wurden gebeten, für die Dauer der Studie weder Ess- und Rauchgewohnheiten noch körperliche Aktivität zu ändern. Ausschlusskriterien waren kardiovaskuläre, thromboembolische und endokrinologische Erkrankungen in der Vorgeschichte, östrogenabhängige Neoplasien und erhöhter Konsum von Alkohol oder Drogen sowie auch relevante Abweichungen klinischchemischer Laborparameter von Leber- und Nierenfunktion.

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Venöse Blutabnahmen wurden unmittelbar vor Studienbeginn als Basismessung sowie im Studienverlauf nach 6, 12 und 24 Monaten durchgeführt. Dazu mussten die Probanden nüchtern sein und eine wenigstens 10-stündige Rauch- sowie 24-stündige Alkoholkarenz einhalten. Die Blutentnahmen erfolgten dann zwischen 8 und 10 Uhr morgens nach einer wenigstens 20-minütigen Ruhepause. Die Proben wurden innerhalb einer Stunde nach

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Entnahme bei 3000g und 4°C für 30 Minuten zentrifugiert und nach Aufteilung in Aliquots (1 ml Eppendorfgefäße) in flüssigem Stickstoff schockgefroren bei -70°C bis zum Zeitpunkt der Analyse aufbewahrt. Da nach der Zentrifugation dem Serum kein Antioxidanz wie z. B. 3,5- di-tert-butyl-4-hydroxytoluol (BHT) zugesetzt wurde, konnten wir nicht ausschließen, dass ein gewisser Anteil von Cholesterin bei der Probenasservierung und vor der Aufarbeitung bereits autoxidativ in 7α-Hydroxycholesterin umgewandelt wurde.

Anmerkungen

Als "keine Wertung" eingestuft, da es sich um eine reine Methodenbeschreibung handelt. Auch hier sollten wörtliche Übernahmen gekennzeichnet werden -- insbesondere auch um mit gleichen Methoden erstellte Studien leicht identifizieren zu können.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[2.] Whs/Fragment 012 01 - Diskussion
Bearbeitet: 1. August 2017, 22:36 (Hindemith)
Erstellt: 14. February 2015, 07:23 SleepyHollow02
Fragment, Gesichtet, KeineWertung, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Whs

Typus
KeineWertung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes
Untersuchte Arbeit:
Seite: 12, Zeilen: 1ff (komplett)
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 31 ff., Zeilen: 31: 3 ff.; 32: 26 ff.; 33: 1 ff.
[Da nach der Zentrifugation dem Serum kein Antioxidanz wie z. B. 3,5-] di-tert-Butyl-4-Hydroxy-Toluol (BHT; Merck, KGaA, Darmstadt) zugesetzt wurde, konnten wir nicht ausschließen, dass ein gewisser Anteil von Cholesterin bei der Probenasservierung und vor der Aufarbeitung bereits autoxidativ in 7α-Hydroxycholesterin umgewandelt wurde. Daher verzichteten wir in unserer Untersuchung auf die Bestimmung dieser Gallensäurenvorstufe.

2.3 Probenaufarbeitung

Die Sterine in den Serumproben werden zur gaschromatographischen (GC) Trennung mit anschließender Flammenionisationsdetektion (FID) oder massenselektiver Detektion (MSD) im Scan oder Selected Ion-Monitoring (SIM) Modus zunächst in ihre freie Form gebracht, indem durch eine alkalische Hydrolyse die fettsäureveresterten Sterine dekonjugiert werden. Danach werden die freien Sterine extrahiert und mittels eines Silylierungsreagenzes in einen Silylsterinäther umgewandelt (Lütjohann et al., 2000).

→ Die tiefgefrorenen Serumproben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut.

→ 1 μg Epicoprostanol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München) (10 μl einer Stammlösung von 100 μg/ml in Cyclohexan, Merck KGaA, Darmstadt), 50 μg 5α- Cholestan (Serva Feinbiochemika GmbH, Heidelberg) (50 μl einer Stammlösung von 1 mg/ml in Cyclohexan) und jeweils 100 ng razemisches [23,23,24,25-2H4]24(R,S)- Hydroxycholesterin (Klinische Chemie, Karolinska-Institut, Stockholm, Schweden, (Dzeletovic et al., 1995)) und [15,16,17,20,22-2H5]27-Hydroxycholesterin (Klinische Chemie, Karolinska-Institut, Stockholm, Schweden, (Dzeletovic et al., 1995)) (100 μl einer Stammlösung eines Gemisches von [2H4]24(R,S)-Hydroxycholesterin und [2H5]27-Hydroxycholesterin, 1 μg/ml in MeOH, Merck, KGaA, Darmstadt) wurden als interne Standards zu 200 μl der Serumprobe bei Raumtemperatur in einem Teflon-beschichteten Reagenzglas mit Schraubverschluss zugesetzt.

→ Zur Vermeidung von weiteren autoxidativen Prozessen wurden außerdem noch 50 ng BHT (10 μl aus einer Stammlösung von 50 mg BHT/10 ml MeOH) zugesetzt.

→ Zur alkalischen Hydrolyse wurde das Probengemisch nach Zusatz von 1 ml 90%-iger äthanolischer NaOH-Lsg. (1M) (Merck, KGaA, Darmstadt) im Wasserbad bei 68°C über 1 Stunde inkubiert.

→ Nach Abkühlen auf Raumtemperatur und Zusatz von 500 μl aqua bidest. wurden die freien Sterine zweimal in 3 ml Cyclohexan (Merck KGaA, Darmstadt) extrahiert.

Da nach der Zentrifugation dem Serum kein Antioxidanz wie z. B. 3,5- di-tert-butyl-4-hydroxytoluol (BHT) zugesetzt wurde, konnten wir nicht ausschließen, dass ein gewisser Anteil von Cholesterin bei der Probenasservierung und vor der Aufarbeitung bereits autoxidativ in 7α-Hydroxycholesterin umgewandelt wurde. Daher verzichteten wir in unserer Untersuchung auf die Bestimmung dieser Gallensäurenvorstufe.


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2.5 Probenaufarbeitung

Die Sterine in den Serumproben werden zur gaschromatographischen Trennung mit anschließender Flammenionisationsdetektion oder massenselektiver Detektion zunächst in ihre freie Form gebracht, indem durch eine alkalische Hydrolyse die fettsäureveresterten Sterine dekonjugiert werden. Danach werden die freien Sterine extrahiert und mittels eines Silylierungsreagenzes in einen Silylsterinäther umgewandelt.

[Seite 33:]

􀂾 Die tiefgefrorenen Serumproben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut.

􀂾 1 μg Epicoprostanol (10 μl einer Stammlösung von 100 μg/ml in Cyclohexan), 50 μg 5α-Cholestan (50 μl einer Stammlösung von 1 mg/ml in Cyclohexan) und jeweils 100 ng razemisches [23,23,24,25-2H4]24R,S-Hydroxycholesterin und [15,16,17,20,22- 2H5]27-Hydroxycholesterin (100 μl einer Stammlösung eines Gemisches von [2H4]24R,S-Hydroxycholesterin und [2H5]27-Hydroycholesterin, 1 μg/ml in MeOH) wurden als interne Standards zu 200 μl der Serumprobe bei Raumtemperatur in einem Teflon-beschichteten Reagenzglas mit Schraubverschluss zugesetzt.

􀂾 Zur Vermeidung von autoxidativen Prozessen wurden außerdem noch 50 ng 3,5-ditert- butyl-4-hydroxytoluene (BHT) (10 μl aus einer Stammlösung von 50 mg BHT/10 ml MeOH) zugesetzt.

􀂾 Zur alkalischen Hydrolyse wurde das Probengemisch nach Zusatz von 1 ml 90%-iger äthanolischer NaOH-Lsg. (1M) im Wasserbad bei 68°C über 1 Stunde inkubiert.

􀂾 Nach Abkühlen auf Raumtemperatur und Zusatz von 500 μl aqua bidest. wurden die freien Sterine, Stanole und Oxysterine zweimal in 3 ml Cyclohexan extrahiert.

Anmerkungen

Als "keine Wertung" eingestuft, da es sich um eine reine Methodenbeschreibung handelt. Auch hier sollten wörtliche Übernahmen gekennzeichnet werden -- insbesondere auch um mit gleichen Methoden erstellte Studien leicht identifizieren zu können.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

[3.] Whs/Fragment 013 01 - Diskussion
Bearbeitet: 1. August 2017, 22:40 (Hindemith)
Erstellt: 14. February 2015, 07:32 SleepyHollow02
Fragment, Gesichtet, KeineWertung, Pinsdorf 2005, SMWFragment, Schutzlevel, Whs

Typus
KeineWertung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes
Untersuchte Arbeit:
Seite: 13, Zeilen: 1 ff.
Quelle: Pinsdorf 2005
Seite(n): 33 ff., Zeilen: 33: 16 ff; 34: 3 ff.; 35: 22 ff.; 36: 13 ff. 37: 1 f.
→ Die vereinigten organischen Phasen wurden unter Stickstoffbegasung bei 65°C getrocknet.

→ Die Hydroxylgruppen der Sterine wurden nach Zugabe von 1 ml eines Trimethylsilylierungs- (TMS-) Reagenzes (Pyridin-Hexamethyldisilazan- Trimethylchlorsilan, 9:3:1; v/v/v) (Merck, KGaA, Darmstadt) zum Rückstand nach 1- stündiger Inkubation bei 65°C zu TMS-Äthern derivatisiert.

→ Die restlichen Silylierungsreagenzien wurden daraufhin unter Stickstoffbegasung bei 65°C verdampft.

→ Der Rückstand wurde in 160 μl n-Dekan (Merck KGaA, Darmstadt) gelöst.

→ 80 μl dieses Gemisches an Sterintrimethylsilyläthern in n-Dekan wurden in die Mikroeinsätze der Glasphiolen für die GC-MSD-Analyse überführt.

→ Die übrigen 80 μl wurden mit 500 μl n-Dekan für die GC-FID-Analyse verdünnt.

→ Die Glasphiolen wurden zur eindeutigen Identifizierung beschriftet.


2.4 Beschreibung der Analyseverfahren

Cholesterinvorstufen und -metabolite wie das 24S- und das 27-Hydroxycholesterin liegen im Serum in einer 103 bis 104-fach geringeren Konzentration als ihre Ausgangssubstanz Cholesterin vor. Daher wird die Konzentration des Cholesterins in Serumproben durch die weniger spezifische und selektive Flammenionisationsdetektion nach gaschromatographischer Trennung bestimmt, während die Cholesterinvorstufen und - metabolite durch die hochspezifische und -sensitive massenselektive Detektion aus der gleichen Probenaufarbeitung erfasst werden. Die Identifizierung von Cholesterin erfolgt über den Vergleich der Retentionszeiten mit zertifizierter Referenzsubstanz und die Quantifizierung erfolgt über einen zu Beginn der Aufarbeitung zugesetzten internen Standard (5α-Cholestan), der physiologischerweise nicht im Serum enthalten ist und dem zu bestimmenden Sterin chemisch möglichst ähnlich ist.

Nutzt man die Massenspektrometrie zur Strukturidentifizierung, muss eine kontinuierliche Aufnahme von Massenspektren über einen großen Massenbereich (z.B. 50-600 m/z) erfolgen (Scan Modus), d.h. man registriert alle Ionen, in die eine Substanz zerfällt, nach Masse- Ladungs-Verhältnis und nach relativer Intensität. Bei der Quantifizierung beschränkt man sich auf die Aufzeichnung von wenigen charakteristischen Massen, bei denen die Verbindung Fragmente höchster Intensität bildet (SIM Modus). Die Messzeit auf den ausgewählten und zyklisch registrierten Massen wird verlängert und so die Empfindlichkeit der Messung (Sensitivität) um den Faktor 30 bis 50 gesteigert (Hübschmann, 1996).

􀂾 Die vereinigten organischen Phasen wurden unter Stickstoffbegasung bei 65°C getrocknet.

􀂾 Die Hydroxylgruppen der Sterine und Stanole wurden nach Zugabe von 1 ml eines Trimethylsilylierungsreagenzes (Pyridin-Hexamethyldisilasan-Trimethylchlorsilan, 9:3:1; v/v/v) zum Rückstand nach 1-stündiger Inkubation bei 65°C zu Trimethylsilyläthern derivatisiert. Als Beispiele sind die Silylierungen von 24S- und 27-Hydroxycholesterin in Abb. 9 aufgeführt.

􀂾 Die restlichen Silylierungsreagenzien wurden daraufhin unter Stickstoffbegasung bei 65°C verdampft.

􀂾 Der Überstand wurde in 160 μl n-Dekan gelöst.

􀂾 80 μl dieses Gemisches an Sterintrimethylsilyäthern in n-Dekan wurden in die Mikroeinsätze der Glasphiolen für die GC-MSD-Analyse überführt.

􀂾 Die übrigen 80 μl wurden mit 500 μl n-Dekan für die GC-FID-Analyse verdünnt.

􀂾 Die Glasphiolen wurden zur eindeutigen Identifizierung beschriftet.

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2.6 Beschreibung der Analyseverfahren

Cholesterinvorstufen und -metabolite wie das 24S- und das 27-Hydroxycholesterin liegen im Serum in einer 103 bis 104-fach geringeren Konzentration als ihre Ausgangssubstanz Cholesterin vor. Daher wird die Konzentration des Cholesterins in Serumproben durch die weniger spezifische und selektive Flammenionisationsdetektion bestimmt, während die Cholesterinvorstufen und -metabolite durch die hochspezifische massenselektive Detektion erfasst werden.

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Die Quantifizierung erfolgt über einen zu Beginn der Aufarbeitung zugesetzten internen Standard (5α-Cholestan), der physiologischerweise nicht im Serum enthalten ist, und der zu bestimmenden Substanz chemisch möglichst ähnlich ist.

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Nutzt man die Massenspektrometrie zur Strukturidentifizierung, muss eine kontinuierliche Aufnahme von Massenspektren über einen großen Massenbereich (z.B. 50-600 m/z) erfolgen (Scan-Modus), d.h. man registriert alle Ionen, in die eine Substanz zerfällt, nach Masse-Ladungs-Verhältnis und nach relativer Intensität. Dabei ist die Messzeit auf jeder Masse kurz. Das erhaltene Massenspektrum ist wie ein „Fingerabdruck” für die zu untersuchende Substanz. Bei der Quantifizierung beschränkt man sich auf die Aufzeichnung von wenigen charakteristischen Massen, bei denen die Verbindung Fragmente höchster Intensität bildet (Selected Ion- Monitoring [SIM] Modus). Die Messzeit auf den ausgewählten und zyklisch registrierten

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Massen wird verlängert und so die Empfindlichkeit der Messung um den Faktor 30 bis 50 gesteigert (Hübschmann, 1996).

Anmerkungen

Als "keine Wertung" eingestuft, da es sich um eine reine Methodenbeschreibung handelt. Auch hier sollten wörtliche Übernahmen gekennzeichnet werden -- insbesondere auch um mit gleichen Methoden erstellte Studien leicht identifizieren zu können.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith

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